其他亲和层析

1、关于 NHS 和 CNBr有什么区别，怎样选择？
答：CNBr 与 NHS 预活化填料最主要的区别是 ： NHS 预活化填料的反应位点与填料基架之间有 10(HP) 或 14(FF) 个原子的间隔臂，而 CNBr 则没有。
对于小分子配基 (< 5 KD)，当配基和样品结合的时候，由于 CNBr 没有间隔臂，可能会由于空间位阻而影响结合，在这种情况下，建议使用 NHS 活化配基填料。
对于大于 5KD 的配基，二者差异不大。
CNBr 较 NHS 产品出现更早，因此经常出现在文献中。一般 NHS 可以替代 CNbr 的应用，建议优先选择 NHS配基。NHS 也有预装柱形式的 HiTrap NHS activated HP。

2、CNBr 4B 填料已经偶联了蛋白，是否可以剥离后再偶联别的蛋白？
答：预活化的填料保存在酸性的环境中，偶联后未被偶联的位点也在碱性条件下被封闭了，这个过程是不可逆的，因此不能剥离再偶联其他蛋白。

3、 Capto Heparin 填料为何可以用于 DNA 结合蛋白的纯化？
答：配基为肝素，一种高度硫酸化的糖胺聚糖。这是一款族特异性填料， 同时具有亲和和离子交换作用。
亲和作用 ：用于纯化血浆蛋白 PCC， Factor IX， ATIII 以及生长因子等 ；
离子作用 ：模拟了核酸骨架的多负电荷结构，用于纯化核酸结合蛋白等。

4、Blue Sepharose 填料，掉蓝色正常吗？
答：Blue 的配基是活性蓝色染料辛巴蓝 (Cibacron Blue F3GA)，刚开始配基都是过饱和的，使用之后有一些配基脱落是正常的。基于新一代基架的 Capto Blue 配基脱落会更少一些。

5、用于金属离子螯合的 Chelating Sepharose 和 IMAC Sepharose 填料的区别是什么？
答：两者均可以与过渡金属离子螯合，但其配位方式不同。以镍离子螯合为例， Chelating 采用的是 IDA 的配位方式，镍离子可形成六个配位键，其中与基架配基形成三个配位键，剩余三个用于捕获蛋白 ；而 IMAC 则是类似NTA的配位方式，四个配位键与配基螯合，因此镍离子稳定性更好。两者因螯合方式不同，镍离子结合力也存在细微差距，在对不同蛋白的纯化过程中表现出不同的选择性。

6、MBP标签洗脱得到的蛋白少？
答：
蛋白流穿未结合：
•    结合缓冲液PH>7，5mM DTT，10%甘油可能影响收率。
•    培养基中加入葡萄糖，抑制淀粉酶表达。
•    MBP标签结合位点被遮蔽，调整Linker。
蛋白发生沉淀：
•    降低上样量。
•    尝试在Buffer中加入去垢剂或调整盐浓度。
•    洗脱方式改为线性梯度洗脱。

7、MBP标签洗脱得到的蛋白较杂？
答：
•    标签蛋白降解
加入蛋白酶抑制剂；改变MBP标签位置；buffer加入EDTA。
•    杂质通过二硫键与蛋白结合
加入还原剂。
•    以其他形式互作的杂质
提高离子强度（1M NaCl）或加入温和的去垢剂（注意去垢剂可能会影响结合）。

8、MBP填料或者预装柱填料如何清洗和再生？
答：先冲3CV去离子水，接着用0.5M NaOH冲洗3 CV，再冲3 CV去离子水，1 ml预装柱用流速0.5-1 ml/min，5ml预装柱用2.5-5 ml/min，最后用5 CV结合缓冲液平衡冲洗。其中0.5 M NaOH可以用0.1%SDS在室温下清洗填料。

9、Strep XT填料或者预装柱如何清洗和再生？
答：
填料再生：
用150 cm/h流速，先用3 CV去离子水清洗，接着用NaOH清洗3min，然后再用3 CV去离子水冲洗，最后再用8 CV结合缓冲液清洗。
填料清洗：
使用0.5M NaOH，避免长时间让填料接触碱液，可以选择用6 M尿素或者4M盐酸胍清洗，同时5M NaCl可以清除DNA。