《Nature Immunology》亮点！MAIT细胞通过抵抗氧化损伤保护脑膜屏障完整性和大脑认知功能

免疫系统和大脑之间的相互作用仍然是一个令人好奇的迷。最近的研究发现，大脑屏障区域，包括血脑屏障、血脑脊液屏障、血脑膜屏障，似乎是神经细胞与免疫细胞相互作用的中心 (Rua and McGavern 2018, Alves de Lima, Rustenhoven et al. 2020)。

 
图一示：血脑膜屏障（BMB）、血脑脊液屏障（BCSFB）、血脑屏障（BBB）来源(Alves de Lima, Rustenhoven et al. 2020)

脑膜中有丰富的免疫细胞，包括B细胞、T细胞、先天淋巴样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、巨大细胞。脑膜中有丰富的血管，为细胞生长提供营养。更重要的是，脑脊液流经脑膜，为脑膜免疫细胞与神经系统相互作用提供基础 (Rua and McGavern 2018)。

 
图二示脑膜结构，来源(Rua and McGavern 2018)

MAIT细胞（Mucosal associated invariant T cells）是人类中最丰富的先天淋巴样细胞，具有强大的细胞毒性活性，可以通过TCR依赖和独立的方式发挥作用。MR1蛋白负责将细菌产生的维生素B2和B9代谢物呈递给MAIT细胞。MAIT细胞分泌促炎因子，裂解细菌感染的细胞。MAIT细胞被认为在自身免疫性疾病（多发性硬化、关节炎、炎症性肠病）中发挥作用 (Hinks and Zhang 2020, Nel, Bertrand et al. 2021)。

2022年11月21日，来自美国罗格斯大学的Qi Yang研究团队在《Nature Immunology》发表题为“Mucosal-associated invariant T cells restrict reactive oxidative damage and preserve meningeal barrier integrity and cognitive function”的文章 (Zhang, Bailey et al. 2022)，发现MAIT细胞存在于脑膜中，并随着年龄的增加而积累。小鼠脑膜MAIT细胞高表达多种抗氧化分子，包括Selenop、Selenof和Fth1。在肝脏、皮肤和肺等其他非淋巴器官中，这些抗氧化分子也在MAIT细胞中高度表达。这些结果表明，MAIT细胞在限制组织氧化物方面发挥重要生理作用。在MAIT细胞缺陷（Mr1-/-）小鼠中，脑膜中活性氧积累，脑膜屏障上紧密连接蛋白和粘附连接蛋白减少，脑实质炎症和认知功能缺陷。抗氧化谷胱甘肽可部分缓解Mr1-/-小鼠的小胶质细胞增生和认知缺陷。这些数据证明脑膜淋巴细胞在维持脑膜屏障完整性方面的重要作用。
以下是具体研究内容：

MAIT细胞存在于脑膜中
MAIT细胞是人类中最丰富的先天样T细胞，在肝脏、皮肤和粘膜屏障中富集。MAIT细胞是否存在于脑相关组织中仍是未知数。我们消化了C57BL/6小鼠的脑膜和脉络膜组织，并用MR1四聚体对细胞进行染色，以确定潜在的MAIT细胞。在野生型小鼠的脑膜和脉络膜中检测到一个清晰的MAIT细胞群（图1a）。MAIT细胞的数量随年龄增长而增加（图1a，b）。MAIT细胞在脑膜中的丰度大于年龄匹配的小鼠的脉络膜（图1a，b）。MAIT细胞在脑实质区域，如皮层和海马区域是不存在的（图1b）。为了验证我们识别MAIT细胞的流式细胞仪方法，我们从7月龄的Mr1-/-  小鼠脑膜中分离出来的细胞进行了MR1四聚体染色，这些细胞缺乏表达MR1的胸腺细胞，用于阳性选择MAIT细胞。由MR1四聚体识别的MAIT细胞在Mr1-/- 小鼠中没有，验证了我们对MAIT细胞的染色和门控策略（图1c，d）。与其他非淋巴组织中的MAIT细胞相似，如肺和皮肤。脑膜MAIT细胞表达中间水平的CD3和TCR以及高水平的IL-7R、IL-18R和Thy1（图1e）。总之，MAIT细胞存在于脑膜中。

 
图1 流式细胞术在小鼠脑膜和脉络丛中检测MAIT细胞

脑膜MAIT细胞表达抗氧化剂分子
我们进行了scRNA-seq来描述脑膜MAIT细胞的分子特性。由于MAIT细胞的频率很低，我们通过荧光激活细胞分选（FACS）富集脑膜MAIT细胞，并将其与CD4+，CD8+ T细胞按1：4：4的比例混合。在UMAP分析中，MAIT细胞表现出独特的转录特征（图2a）。我们确定了238个在脑膜MAIT细胞中高表达的基因，使用FDR<0.05和细胞表达百分比（pct.）>0.25的阈值。Ingenuity Pathway分析（IPA）显示，脑膜MAIT细胞的特征性基因在与机体损伤、细胞发育和增殖以及自由基清除有关的网络中富集。特别是，涉及Selenop的自由基清除基因网络由脑膜MAIT细胞高度表达（图2b）。这些数据共同揭示了MAIT细胞的独特的基因表达谱。

我们接下来在脑膜T细胞高表达的238个基因中寻找分泌蛋白，因为分泌蛋白有可能影响周围微环境中其他细胞的行为。在所有被MAIT细胞高度表达的基因中，有7个分子是已知的分泌蛋白，具有改变周围微环境和影响其他细胞活动的功能潜力。这7个编码分泌蛋白的基因包括Tnf、Tnfsf14、Selenop、Fth1、Tmsb4x、Psap和Selenof。正如以前报道的其他解剖部位的MAIT细胞一样脑膜MAIT细胞表达高水平的Tnf和Tnfsf14。其余5个由脑膜MAIT细胞高表达的分泌蛋白以前没有报道过。有趣的是，这5种分泌蛋白都具有抗氧化特性（图2c-e）。这些分子包括硒转运体Selenop和Selenof。铁蛋白重链Fth1，胸腺素4和prosaposin (图2c-e）。表达这些抗氧化分子的脑膜MAIT细胞的百分比和MAIT细胞的这些抗氧化基因的表达水平在平衡状态下非常高（图2c-e）。这与平衡期脑膜中MAIT细胞对Il17和Ifng的相对适度表达形成对比（图2c-e）。因此，MAIT细胞表达了大量的抗氧化剂分子，表明它们可能拥有调节组织氧化损伤的能力。

我们接下来分析了我们以前发表的MAIT细胞在其他组织中的scRNA-seq。事实上，抗氧化基因Selenop和Fth1在其他非淋巴组织中被MAIT细胞高度表达，包括皮肤、肺和肝（图2f-h）。因此，抗氧化分子的高表达是MAIT细胞在多种非淋巴组织中的特征。

 
图2 单细胞RNA测序技术分析MAIT细胞的分子特征

MAIT细胞保持脑膜屏障的完整性
由于MAIT细胞表达的抗氧化分子可能被释放到周围的微环境中，从而影响其他细胞的活动。值得注意的是，氧化损伤的增加可能导致脑膜屏障渗漏。因此，我们研究了MAIT细胞的缺失是否会导致脑膜屏障完整性受到损害。我们使用改良的SR101经颅实验来研究脑膜屏障的完整性。我们在MAIT缺陷的Mr1-/- 和对照的野生型小鼠前囟门周围的完整颅骨表面施以SR101。然后我们在SR101给药后20分钟用振动切片机检查SR101的分布。我们首先检查了7个月大的小鼠。在7个月大的野生型小鼠中，SR101穿透了颅骨，但没有通过脑膜屏障下面（图4a）。然而，在7个月大的Mr1-/- 小鼠中，观察到SR101在脑膜屏障下的明显泄漏（图4a，b）。值得注意的是，我们在5周大的Mr1-/- 小鼠中没有观察到脑膜屏障的渗漏，这表明脑膜屏障的缺陷不是由于早期发育缺陷造成的（图4c，d）。总之，这些数据表明，MAIT细胞的存在可能是维持老年小鼠脑膜屏障完整性的必要条件。

 
图4 MAIT细胞保护脑膜屏障的完整性

MAIT细胞在平衡状态下抑制神经炎症
当脑膜屏障受到损害时，不需要的毒素可能会不正常地进入脑实质，从而引发小胶质细胞过度活化。因此，我们研究了MAIT细胞是否可能在抑制平衡状态下的神经炎症中发挥重要作用。我们对Iba-1进行免疫荧光染色，检查小胶质细胞的丰度和形态。在7个月大的Mr1-/- 小鼠的大脑皮层观察到明显的小胶质增生（图6a，b），并扩散到海马区（图6a，b）。因此，MAIT细胞在平衡状态下压制小胶质细胞。 

由于海马对认知功能有贡献，并且对神经炎症很敏感，我们接下来研究了海马中小胶质细胞的分子特性变化。我们使用基于木瓜蛋白酶的组织解离试剂盒（Thermo）分离海马细胞，并进行scRNA-seq。scRNA-seq是用FACS筛选的活细胞进行的，排除死细胞（DAPI+）和碎片（Draq5-）。大部分活的神经元无法通过FACS获得，可能是由于它们的脆弱性。在UMAP分析中，小胶质细胞与其他海马细胞明显区分开来。对小胶质细胞群体的进一步分析确定了7个月大的小鼠海马中的2个主要的小胶质细胞亚群，这里称为M-h和M-a（图6c-e）。M-h亚群表达了高水平的稳态小胶质细胞特征分子，如P2ry12、P2ry13、Selplg、Cst3和Cx3cr1。M-a亚群表达高水平的各种核糖体生物生成基因，表明基因翻译活跃（图6e）。M-a细胞的平均百分比在Mr1-/- 小鼠中比野生型小鼠高（图6d）。百分比之间的统计学差异没有确定，因为样本是集中起来的。与野生型小鼠相比，Mr1-/-小鼠中的小胶质细胞总数表达了更高水平的多个核糖体生物生成基因Uba52、Rps29和Rpl13a。每个M-h和M-a子集的基因表达模式在野生型和Mr1-/- 小鼠之间相似。然而，与野生型小鼠相比，Uba52在Mr1-/-小鼠的每个小胶质细胞亚群中的表达水平高得多（图6f）。核糖体生物生成基因水平的提高可能是Mr1-/-小鼠小胶质细胞增多的原因。

为了探索Mr1-/-小鼠的小胶质症是否与脑膜渗漏有关，我们用谷胱甘肽治疗小鼠4周，以减轻脑膜渗漏，然后通过免疫荧光染色检查小胶质。谷胱甘肽治疗缓解了Mr1-/-小鼠的皮质和海马小胶质的变化（图6h）。这些数据共同表明了一个模型，其中Mr1-/-小鼠的ROS积累增加导致脑膜渗漏，然后使脑实质发炎。

 
图6 MAIT细胞抑制神经炎症

MAIT细胞保持认知功能
我们接下来进行了一系列的行为测试，以检查MAIT细胞在调节认知功能方面的作用。我们首先检查了7个月大的Mr1-/-和对照野生型小鼠的行为和认知功能。在Y型迷宫测试中，Mr1-/- 小鼠无法区分熟悉的手臂和新的手臂的位置，这表明空间识别方面的缺陷（图7a）。Mr1-/- 小鼠在水迷宫测试的训练期表现出较高的逃避潜伏期，表明在学习方面存在缺陷（图7b）。此外，在水迷宫测试的探测试验中，Mr1-/- 小鼠进入目标区的次数明显减少，在目标象限内花费的时间百分比减少，到目标区的潜伏期增加，这表明空间记忆的缺陷（图7c）。总之，Mr1-/- 小鼠在7个月大时表现出认知功能受损。

为了验证MAIT细胞在调节认知功能方面的具体作用，我们对7个月大的Mr1-/- 小鼠进行了有无MAIT细胞转移的行为测试。将MAIT细胞转移到Mr1-/- 小鼠身上，可以防止Y型迷宫测试中的空间识别缺陷（图7d）。转移MAIT细胞还导致水迷宫训练期的逃逸潜伏期减少，表明空间学习的改善（图7e）。在水迷宫测试试验中，MAIT细胞的转移增加了进入目标区的次数，提高了在目标象限的时间百分比，并减少了进入目标区的潜伏期，表明MAIT细胞的存在有助于保存空间记忆（图7f）。此外，MAIT细胞的转移使水迷宫测试的反向训练和探测试验中的复杂学习和记忆得到改善（图7g，h）。

 
图7 MAIT细胞对认知功能的作用

讨论
在这里，我们揭示了MAIT细胞在抑制组织ROS积累和维护脑膜平衡及认知功能方面的新作用。我们表明，MAIT细胞存在于脑膜中，并表达高水平的抗氧化分子。我们证明，MAIT细胞的缺失会导致脑膜ROS的积累和屏障渗漏，从而使脑实质发炎并导致认知能力下降。总之，我们的数据为脑膜中的MAIT细胞建立了一个重要的功能作用，并表明脑膜免疫细胞可以通过维护脑膜屏障的平衡和完整性来帮助维持正常的神经功能。

免疫系统和中枢神经系统之间的相互作用目前是一个密集研究的领域。然而，免疫细胞促进正常神经功能的具体机制并不完全清楚。以前的研究集中在居住在硬脑膜的脑膜免疫细胞是否以及如何通过细胞因子远程影响脑实质的神经活动。相反，我们的工作表明，脑膜免疫细胞特定亚群的缺失会导致自由基的堆积、脑膜屏障的退化、脑实质内的炎症，并最终破坏正常的神经功能。因此，这项工作表明，脑膜免疫居民有可能通过维护脑膜平衡来积极维持正常的中枢神经系统功能和行为。

 

优宁维实验操作视频推荐 请扫描下方二维码到小优博士小程序查看

实验操作视频路径	名称
小优博士流式基础知识	流式细胞分析
小优博士免疫荧光技术流程及常见问题解决	免疫荧光染色
小优博士CRISPR基因编辑技术及应用	CRISPR
小优博士BD Rhapsody单细胞测序技术	单细胞RNA测序

 

参考文献
Alves de Lima, K., J. Rustenhoven and J. Kipnis (2020). "Meningeal Immunity and Its Function in Maintenance of the Central Nervous System in Health and Disease." Annu Rev Immunol 38: 597-620.
Hinks, T. S. C. and X. W. Zhang (2020). "MAIT Cell Activation and Functions." Front Immunol 11: 1014.
Nel, I., L. Bertrand, A. Toubal and A. Lehuen (2021). "MAIT cells, guardians of skin and mucosa?" Mucosal Immunol 14(4): 803-814.
Rua, R. and D. B. McGavern (2018). "Advances in Meningeal Immunity." Trends Mol Med 24(6): 542-559.
Zhang, Y., J. T. Bailey, E. Xu, K. Singh, M. Lavaert, V. M. Link, S. D'Souza, A. Hafiz, J. Cao, G. Cao, D. B. Sant'Angelo, W. Sun, Y. Belkaid, A. Bhandoola, D. B. McGavern and Q. Yang (2022). "Mucosal-associated invariant T cells restrict reactive oxidative damage and preserve meningeal barrier integrity and cognitive function." Nat Immunol.