【罗工秘籍63】上机操作那些事——电压阈值

流式的上机操作总是难倒一片初学流式的英雄好汉。很多刚接触流式的老师都困在了这个仪器不会操作上，尤其是仪器平台也没有老师帮忙的，一切还得全靠自己，按照仪器操作指南我能顺利开机关机，新建文件，但是一上样本就难住了。到底哪些参数是需要调节的呢？这里小编就为大家简单做个总结和介绍。

对于基础的分析实验，上机最主要调节的就是仪器的电压（或增益）值，还有就是去杂质的阈值。补偿值也可以在仪器上稍作调节，可以初步看一下数据的分群结果，当然这个参数值也可以记录完所有数据后再导出放到Flowjo软件上去调节，也是可以的。所以本文主要介绍电压参数和阈值。

 

一、电压（增益）参数：

电压即光电倍增管（PMT,光子计数器件）的工作电压。电压越高，单个光子转换成电子的数量越多，反之亦然。对于大多数仪器来说，电压参数是必须在上机预览样本的时候才能调节的，一旦采集记录数据，电压就无法再更改的，除非重新上样调节。需要调电压的通道包括FSC和SSC散射光电压调节，确保检测的目标群在显示范围中心；其次是使用到的各个荧光通道，确保阴阳分群效果的同时，阳性群又不会跑出最大显示范围（所以调电压并非严格只用空白对照，可以用单染辅助调节）。

 

 FSC/SSC电压参数调节合适能顺利找到目标细胞群体。

 

荧光通道电压参数调节合适能，更好的提高待测marker分群水平。

 

不同的仪器调节的数值是有差异的，没有可比性。另不同的仪器调节手法也是有差异的：

如BD的流式仪器主要就是调节电压参数，电压调好了，数据采集基本就没有问题了；

Beckman的仪器需要注意电压值和补偿值的适应性，两个补偿大的荧光通道，电压相差不能太大（例如某被溢漏的通道电压增益只有19，干扰该通道的荧光通道电压增益却是高达500），否则会导致补偿值异常大，在满足分群的基本条件下，尽量减少相邻通道或有干扰的两个通道之间的电压增益值差距；

安捷伦的流式分析仪（如：NovoCyte），比较特殊，很多时候它的电压值是工程师已经调好的，我们上机时是不需要修改的，只需要修改显示范围，确保目标群都在合适的可视范围，且同一套样的各个荧光通道显示范围一致即可，导出数据的时候就可以根据图形导出，确保样本之间的可比性。

 

二、各个通道的信号放大输出模式：

线性放大（lin）：适用于较小范围内变化的信号，或代表生物学线性过程的信号，例如：FSC、SSC、细胞周期检测等。

对数放大（log）：应用于荧光染色的情况，也就是基本荧光通道都用log；特殊实验中检测对象较小时，可能FSC和SSC也会选择用log，比如做多因子检测的CBA，血小板检测等。

 

三、阈值（Threshold）：

阈值就是排除信号的一个大小范围，合理调节阈值会有效排除多余的碎片信号，减少无用数据量。如图所示，在FSC阈值较低的情况下能看到左下有较多的碎片信号，当把FSC阈值调高以后，就少了很多这样的碎片信号。

 

 

那么我们上机的时候只要把这些最重要的参数调节合适了，我们就能达到很好的流式数据获取的目的。

 

BD的FACSCelesta上机操作，可观看如下视频：

（注：BD旗下的流式仪，只要是Diva系统操作界面基本一致，可作为参考）

https://www.bilibili.com/video/BV1Qb4y1v7K7/?spm_id_from=autoNext&vd_source=5c737735debfdb33bc734c4d17d12891