【罗工流式宝典第12式】看似简单的CFSE增殖检测居然有这么多讲究

细胞增殖是生物体的重要生命特征。研究细胞增殖，对于理解细胞发育和分化，探索疾病的发病机制和临床治疗方法的安全性评估等都有着重要的意义。传统的测定细胞增殖的方法主要有MTT/CCK8比色法，Brdu法，3H-TdR同位素掺入法。其不足之处分别在于：比色法只能在总体水平上提供细胞数总量变化的信息，不能在单个细胞水平上分析细胞增殖信息；Brdu法只能检测处于S期的细胞，仅能反应细胞增殖率，适用于短期检测；而同位素法则存在放射性污染。

 

CFSE染色方法和数据分析方法与传统方法相比具有很大的优势，能与流式细胞染色技术相结合，在单个细胞水平上检测细胞增殖，且能够动态的分析细胞增殖。且对CFSE数据分析方面，Flowjo等流式分析软件，都有现成的增殖拟合算，可以得到相对定量的分析结果，就更有助于人们了解细胞存活或死亡的机制。

 

一、原理介绍：

CFSE可自由穿透细胞膜，且一旦进入细胞后不能从细胞中释出，在活细胞内与胞内蛋白进行不可逆的结合，并在细胞内被酯酶水解后释放出绿色荧光，在细胞分裂增殖过程中，它的荧光会平均分配至两个子代细胞中，从而导致荧光强度随着细胞的分裂而逐级递减，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖。

另外，CFSE标记的细胞用于体内观察荧光可保存长达数周之久，它常被用来做活体细胞追踪检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验,为细胞免疫和细胞生物学研究开辟了一条新的有效途径。

二、CFSE母液制备：

CFSE一般购买到的产品为干燥粉末，使用DMSO进行溶解，母液终浓度一般为5 or 10 mM，因粉末体积也需计算在内，请严格按照说明书推荐进行操作。

注：染料粉末可在≤-20°C避光长期保存直至使用。用DMSO溶解后，建议分装保存避免反复冻融，严格按照储存说明储备溶液在≤-20°C可稳定3个月。CFSE的长期存放会使CFSE的标记率随时间延长而下降。

 

三、染色体系：

①染色基本流程：

DPBS洗涤离心收集细胞→DPBS重悬→加CFSE染色→37℃孵育→DPBS洗涤离心收集细胞→含10%FBS的培养基洗涤离心收集细胞→重悬于完全培养基→37℃培养→取细胞洗涤进行后续常规流式染色或直接重悬上机

②染色缓冲液：

使用DPBS是为避免染色环境中存在的叠氮化物、血清或蛋白质结合游离CFSE染料干扰细胞染色，相对PBS效果更佳，千万不可直接在培养基中进行染色孵育。

③细胞染色浓度：

常见的细胞孵育浓度一般在0.5~50×10^6 /ml，但这个细胞浓度范围较广，建议按如下操作进行：

A.对于低浓度的细胞（＜10×10^6 /ml），须在添加蛋白质的情况下标记细胞以缓冲CFSE的毒性作用，CFSE 可能不会诱导细胞死亡，但会抑制正常的细胞分裂。建议在含有 5% (v/v) FBS 的DPBS/PBS中染色。

B.对于高浓度的细胞（10~50×10^6 /ml），蛋白质或培养基成分会降低 CFSE标记的程度。建议在不含蛋白质的DPBS/PBS中染色。

④CFSE浓度：

CFSE初始浓度过高会导致细胞死亡或抑制细胞增殖，过少又会影响标记效率。常用浓度为0.5~5 μM，具体的使用浓度与细胞的抗性和细胞的初始密度也密切相关，各位老师一定要做好充分的预实验。

 

⑤CFSE染色时间：

CFSE的初始浓度在合适范围内时，染色时间对细胞活性和增殖都基本没有影响，但若CFSE浓度高了，细胞的增殖水平则会随着染色的时间增加而降低，一般建议3~5 min相对较佳。

 

四、细胞体外培养时间：

建议原代细胞培养时间一般在48~96 h，48 h后增殖峰开始相对明显，易于组间比较分析，另CFSE会随细胞增殖分裂荧光亮度逐渐减弱，8-9代增殖后基本已无法检出，因此建议不要超过96 h。

 

五、数据分析：

①Flowjo结果分析：

Flowjo软件上有增殖数据拟合的功能，大家可以关注B站up主“半瓶流式小美腻”，参照线上视频指导进行操作：https://www.bilibili.com/video/BV1nf4y1T7w4?spm_id_from=333.337.search-card.all.click

 

②结果图说明：

增殖结果中图片从右至左看，结合未培养的对照管对比，最右侧的峰为初代峰，五指峰分群明显的，可如下左图根据峰值和拟合结果判断分裂代数及每一代的细胞数进行组间的对比。五指峰分群不明显的，或组间差异显著的，也可按照如下右图直接圈取所有处于增殖中的细胞群体，进行组间对比。

③增殖峰的CV值说明：

细胞分裂往往会表现出介导信号传导和细胞命运决定的蛋白质分配不均的细胞异质性。因此培养中的原代细胞，若细胞亚群种类多的，会使细胞的标记率发生差异，表现出相对稍大的CV值（如PBMC，原代T细胞等），其增殖代数依然可依据增殖峰数量进行判断。而随着子细胞之间异质性的加剧使分配不对称程度严重增加（如肿瘤细胞等），会导致世代簇的峰值分辨率较差，无法根据传统拟合手法计算增殖代数，建议直接使用增殖区间的细胞所占总细胞数的百分比进行组间比较。

六、其他注意事项：

①对照设置：

a、未培养但染色的对照细胞，用于确认细胞的初始标记的亮度。

b、培养但未染色的对照细胞，用于确认阴阳性信号及细胞的自发荧光。

②细胞培养过程中很多外界因素都会导致细胞生长状态下降，检疫结合染死活染料，排除死细胞干扰。

 

七、相关产品信息：

产品名称	货号	规格	品牌	检测荧光通道
CFSE	565082	1mg	BD	FITC
CFSE	abs9106	10mg/50mg	Absin	FITC

 

 

参考文献

[1]Quah Benjamin J C, Parish Christopher R, The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation[J].J Vis Exp, 2010, (44).

[2]Bocharov Gennady, Luzyanina Tatyana, Cupovic Jovana et al. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis[J].Front Immunol, 2013, 4: 264.

[3] Falck-Jones S, Vangeti S, Yu M, et al. Functional monocytic myeloid-derived suppressor cells increase in blood but not airways and predict COVID-19 severity[J]. The Journal of clinical investigation, 2021, 131(6).