【罗工流式宝典第18式】BrdU的检测攻略

一、 BrdU原理及其应用方法

1. 原理

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU），一种类似于DNA前体胸苷激酶的物质，在S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中，当细胞处于DNA合成期（S期），而环境中同时又存在BrdU时，BrdU就可经活体注射或细胞培养插入复制的DNA双链中，且这种置换是可以稳定存在，并且可以进一步带到子代细胞中，只要细胞不死亡，其就会在细胞核DNA中长期存留。

掺入到DNA的BrdU可通过免疫学方法、流式细胞术、酶标仪检测吸光值等方法检测DNA中BrdU的含量，从而判断细胞的增殖能力，或作为外源细胞的体内示踪使用。

2. 应用方法

二、实验操作流程

1. 体外实验：

1) 加入10μM BrdU （即1mL培养液中含10μL 1mM BrdU，研究表明该浓度可有效标记各种不同的人、小鼠细胞系和正常细胞群），细胞数量不超过2×106 cells/mL，细胞培养到所需的时间（建议30 – 60 min）；

2) （可选）若有表面染色，加入表面抗体（106 cells /50 μL staining buffer）室温孵育15 min，离心洗涤（1 mL staining buffer，300g，5min）；

3) 100 μL BD Cytofix/Cytoperm Buffer重悬，室温孵育15min或冰上孵育30min，离心洗涤（1 mL 1X BD Perm/Wash Buffer.，300g，5min）；

4) 100 μL BD Cytoperm/Permeabilization Buffer Plus重悬，冰上孵育10min，离心洗涤（1 mL 1X BD Perm/Wash Buffer.，300g，5min）

5) 重复固定，100 μL BD Cytofix/Cytoperm Buffer重悬，室温或冰上孵育5min，离心洗涤（1 mL 1X BD Perm/Wash Buffer.，300g，5min）

6) 100 μL diluted DNase（30 μg/mL）重悬，37℃ 孵育1h，离心洗涤（1 mL 1X BD Perm/Wash Buffer.，300g，5min）

7) 50 μL抗体缓冲液（含荧光anti-BrdU抗体和/或胞内抗体），室温孵育20min，离心洗涤（1 mL 1X BD Perm/Wash Buffer.，300g，5min）

8) （可选）若需要染总DNA用于细胞周期分析，加入20μL 7-AAD重悬细胞。

9) 直接加入1 mL staining buffer重悬细胞

10) 上机检测

注意：样本可在4℃避光保存一晚；若需要长期保存，则可在步骤3之后用细胞冻存液放置-80℃保存，取出后用staining buffer洗涤1遍，直接从步骤5开始往后操作。

结果参考：

文献结果图：

2. 体内实验：

准备：将BrdU用无菌1X DPBS溶解，制备成10 mg/mL BrdU 母液（可用过滤器进行过滤），分装后放-20℃或-80℃保存，避免反复冻融；溶解后的BrdU母液可放4℃存放一周。

1）腹腔注射BrdU

用 100 到 200 μL（1-2 mg）的 BrdU 母液（10 mg/mL）腹腔注射到小鼠体内。

注意：在注射后短短 1 小时内，就可以在胸腺和骨髓中检测到 BrdU 的掺入；而一般在注射后24 h内几乎所有组织都能检测到BrdU。

2）掺入饮用水

在饮用水中将 BrdU 母液（10 mg/mL）稀释至 0.8 mg/mL，并且BrdU 混合饮用水应新鲜配制并每天更换。

注意：长期喂食 BrdU 会对动物产生毒性作用，有研究报告了14 天连续 BrdU 喂养会产生致命影响。另外有研究表面，连续 9 天用 BrdU 喂养小鼠，然后换成普通水同样有效，这个方法在过去 70 天内，BrdU 在细胞都有被检测到。

3）以上两种方式根据实验需要任选其一即可，在合适时间处理小鼠，取血液或组织进行后续染色实验，可提取单细胞悬液做流式或者取组织病理切片做免疫组化/荧光去检测BrdU。

文献结果图：

Fig. B6小鼠脾脏中BrdUrd -标记细胞的积累

三、其他细胞增殖常用试剂对比

四、注意事项

1） BrdU是光敏型，见光易分解，掺入BrdU的细胞也容易见光淬灭，因此都需要避光处理。

2） BrdU不稳定，即使在4℃也不稳定，尽量现配现用。

3） BrdU与抗体结合需要DNA的变性，一般是使用DNA酶或酸处理细胞，所以样品在孵育抗体前需要充分洗涤，任何残留酶或酸都会影响检测抗体。

4） BrdU一般是短时间检测，尽量不要超过一个细胞周期，长时间检测细胞增殖建议用CFSE。

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参考文献：

[1] Kang L, Voskinarian-Berse V, Law E, et al. Characterization and ex vivo Expansion of Human Placenta-Derived Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2013 May 1;4:101. doi: 10.3389/fimmu.2013.00101.

[2] Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973

[3] Matiašová A, Sevc J, Mikeš J, et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochem Cell Biol. 2014 Dec;142(6):703-12. doi: 10.1007/s00418-014-1253-7.

[4] Rocha B, Penit C, Baron C, et al. Accumulation of bromodeoxyuridine-labeled cells in central and peripheral lymphoid organs: minimal estimates of production and turnover rates of mature lymphocytes. Eur J Immunol. 1990 Aug;20(8):1697-708. doi: 10.1002/eji.1830200812.