你必须知道的高效细胞转染方法——电转

细胞转染是指利用各种物理、化学、生物学方法，将外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）导入真核细胞内，来改变细胞的特性，从而达到改造细胞的目的，它是实现细胞基因功能和蛋白质表达研究的重要工具。

 

根据导入的外源分子存在于宿主细胞的时间长短，细胞转染可以分为瞬转和稳转。根据转染方式又可以分为：物理转染法、化学转染法及生物转染法。

 

物理转染法：电穿孔法、显微注射法、基因枪法

化学转染法：磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法、阳离子脂质体法

生物转染法：病毒介导法

 

对于了解或做过细胞转染实验的研究人员，想必上述方法大家都是非常熟悉的，我们也总结了这些方法的原理以及优缺点比较(表1)，帮助大家找到适合自己实验的细胞转染方法。

 

转染方式	具体方法	原理	优点	缺点	应用
物理法	电转	通过脉冲电流在细胞膜上打孔将外源分子导入细胞内	•操作简单，可迅速转染大量细胞 •转染效率高 •无需载体 •适用于各种细胞 •体内体外均可实现基因转移 •结果可重复	•需要仪器 •细胞的死亡率高	瞬转和稳转
	显微注射	利用显微镜，通过微量注射针将外源基因片段注射到细胞中	•靶向性高，可实现单细胞转染 •适用于各种细胞 •无需载体	•需要仪器 •操作困难 •转染细胞数有限 •细胞的死亡率高 •基因表达不稳定	瞬转和稳转
	基因枪	在强电场或高压压缩气体驱动下使微粒子加速运动从而进入细胞和组织中	•适用于各种细胞 •无需载体	•需要仪器 •需要制备微粒 •细胞的死亡率高 •转染效率低	瞬转和稳转
化学法	阳离子脂质体法	带正电荷的DNA——阳离子脂质体复合物，被表面带负电荷的细胞内吞	•快速简单 •结果可重复 •适用于各种细胞 •无需载体	•转染效率受到细胞类型影响 •转染时要除血清 •有细胞毒性	瞬转和稳转
	阳离子聚合物法	带正电的聚合物——DNA复合物，被表面带负电荷的细胞内吞	•快速简单 •结果可重复 •适用于各种细胞 •无需载体	•转染效率受到细胞类型影响 •有细胞毒性 •有些不可生物降解	瞬转
	磷酸钙共沉淀法	磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞	•成本低 •操作简单 •无需载体	•结果可重复性差 •不适用于原代细胞 •有细胞毒性 •不适用于体内基因转移	瞬转和稳转
生物法	病毒介导法	通过侵染，将外源基因有效地整合到宿主染色体上	•转染率较高 •适用于难转染的细胞 •细胞毒性低	•需要病毒载体 •有生物安全问题 •插入片段大小有限 •操作周期长	瞬转和稳转

表1：三种转染方式的原理、优缺点和应用

 

通过各种转染方法的比较，我们发现电穿孔法，也就是电转，无论是在操作方法、适用范围以及转染效率等方面，都有着很大的优势。而现实亦是如此，由于电转的高效、低内毒、操作简单，并且可以瞬时和稳定地表达外源基因，因此常常用于科研领域的新药开发、癌症研究、免疫学研究等。

 

传统的电转实验操作流程，一般先利用电转缓冲液重悬细胞，然后对含有核酸、缓冲液、细胞的混合物给予合适的电脉冲，电脉冲会在细胞膜上形成电势差，从而诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞，最后将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复，检测基因表达或沉默情况。在传统电转实验中，细胞死亡率高，并且原代细胞或干细胞的转染效率较低。考虑到传统电转的弊端，于是科研人员致力于开发更高效的电转技术，电转仪就在这时候横空出世了，目前市面上主流使用的就是Nucleofector™电转仪。

 

1998年，市场上第一个有效的、非病毒介导的Nucleofector™ 技术开发成功，可高效转染传统方法难以转染的原代细胞、干细胞、神经元和细胞系，为疾病研究治疗如基因治疗、免疫治疗和干细胞生成开发带来了新的机遇。Nucleofector™技术是Lonza公司的专利创新技术，利用电击在细胞膜上开个小孔，综合各种特定细胞转染程序与转染液的作用，核酸底物不仅可以进入细胞质，还可直接通过核膜进入细胞核。相较于传统电转技术，Nucleofector™技术的细胞转染率可达99%，且实现转染不依赖于细胞的分裂。

 

货号	产品名称
AAF-1003Y	4D-Nucleofector™ Y Unit
AAF-1003X	4D-Nucleofector™ X Unit
V4XP-1012	P1 Primary Cell 4D X Kit L (12 RCT)
V4XP-2012	P2 Primary Cell 4D X Kit L (12 RCT)
V4XP-3012	P3 Primary Cell 4D X Kit L (12 RCT)
V4XP-4012	P4 Primary Cell 4D X Kit L (12 RCT)
V4XP-5012	P5 Primary Cell 4D X Kit L (12 RCT)
V4XC-1012	SE Cell Line 4D X Kit L (12 RCT)
V4XC-2012	SF Cell Line 4D X Kit L (12 RCT)
V4XC-3012	SG Cell Line 4D X Kit L (12 RCT)

 

看到这里，想必大家都对Nucleofector™技术感到很好奇了，甚至有很多小伙伴表示已经使用过Nucleofector™电转仪了，那么接下来我们就来详细了解一下Nucleofector™技术吧~

 

Nucleofector™电转仪的组成

Nucleofector™电转仪由Nucleofector™仪器、细胞转染试剂盒和数据库组成。

1. Nucleofector™仪器：内置针对每种细胞优化好的转染参数。

2. 试剂盒：试剂盒是包含有转染溶液，添加剂，专用电极杯，吸管，pmaxGFP™阳性质粒。

3. 数据库与操作手册：在Lonza的数据库中提供了600种以上细胞的转染数据和操作手册，包括细胞来源、传代、生长条件，培养基以及转染后培养等细节技巧。

图1：Nucleofector™电转仪组成

 

Nucleofector™电转仪的优势

质粒DNA的转染效率高达90%以上，单核苷酸如siRNA可以达到99%；

良好保存转染细胞的生理状态和活性；

转染后很快就可以分析转染效果；

使用方便，已有超过650种细胞的转染实验方案；

可转染多种底物，包括DNA、mRNA、miRNA、siRNA、肽段或蛋白；

可处理难转染细胞的转染，包括原代细胞、干细胞和神经元等，另可在贴壁状态下转染；

文献引用量高达8000+篇；

使用一次性无菌Nucleocuvette™容器，降低交叉污染的风险；

不同的Nucleofector™平台具有灵活的扩展功能，设备平台之间的条件可轻松转移。

 

实验操作步骤

1.收获目的细胞：按照转染需要的细胞量进行计数，如20 µl电转体系可转1x10⁴-1x10⁶个细胞，100 µl电转体系可转1x10⁵-1x10⁷个细胞；

2.混匀：低速离心，尽量吸去细胞上清，用电转Buffer重悬细胞，加入转染杯，加入准备好的质粒DNA，轻轻混匀，避免产生气泡；

3.电转：将转染杯放入转染仪，按键选择相应程序，按"start"键开始转染，等待指示图标显示绿色“+”号，即可完成实验；

4.培养：吸去电转Buffer，加入预热好的培养基，将细胞转移至培养皿中继续培养。若转染的质粒为试剂盒内的阳性对照质粒，一般在实验结束后7-8h内可在荧光显微镜下观察到实验结果。