免疫分析——MSD电化学发光技术

一、概念

电化学发光 (Electrochemiluminescence ) 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个过程。电化学发光 (Electrochemiluminescence ) 可以应用于所有的免疫测定，电化学发光能取代第一代放射免疫的灵敏度，又继承了第二代酶联免疫的通量方便，因而广泛被全球大量用户所认可和使用，从被载入了免疫分析技术发展的史册。

免疫分析技术发展的三代

二、MSD电化学发光原理

MSD（Meso Scale Discovery）的电化学发光技术是基于Elisa原理的升级，在96/384微孔板（石墨材质，背面带有电路）的板底包被捕获抗体，加入待测样本，加入三联吡啶钌标记的检测抗体，形成双抗体夹心复合物，将微孔板放入MSD仪器中，微孔板通电后，三联吡啶钌发生化学反应，由[Ru(bpy) 3 ] ³⁺变成 [Ru(bpy) 3 ] ²⁺，再回到[Ru(bpy) 3 ] ³⁺，并且这个循环反应可以持续进行，在此过程中会释放出光子（620nm检测）被仪器中的CCD相机捕获，释放出的光子和待测物的浓度成正比。

三、MSD多因子检测原理

（1）MSD通过点阵技术，在96/384石墨电极板里的每个孔的不同spot中预先点印上1-10种捕获抗体，从而实现1-10个指标/每孔的检测。

多因子

通常MSD的V-PLEX试剂盒通过该方法实现多因子检测，下面是几款经典热卖的试剂盒：

K15049D V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit

K15048D V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit

K15059D V-PLEX Proinflammatory Panel 2 Rat Kit

K15396S S-PLEX Proinflammatory Panel 1 (human) Kit（fg/mL灵敏度）

（2）借助linker将捕获抗体带到一个孔中的不同区域内，在一个孔内实现多因子检测。通常U-PLEX试剂盒就是通过该方法实现多因子检测。

1. Linker与捕获抗体连接：

U-PLEX plate每个孔内有1-10个spot，每个spot内有基座分别与不同linker匹配；linker有生物素结合区域，可以结合生物素化的捕获抗体。因此捕获抗体可以被linker带到相应的spot里。

例如检测四种指标，第一步，将四种指标对应的生物素化捕获抗体与四种linker，分别在四支管子内混合，分别完成linker与捕获抗体的偶联，之后加入stop solution终止反应。

2. Linker带着生物素化捕获抗体到一个孔的不同区域：

将四种Linker连接的捕获抗体混合制成混合液A。

将混合液A包被U-PLEX plate，不同的Linker就会带着连接的捕获抗体到相应的spot中，完成在同一个孔内包被多种捕获抗体，实现在一个孔内进行多指标检测（最多可在一个孔中实现10种指标的同时检测）

3. 后续流程同ELISA，完成实验

在板内加入样本进行孵育结合；

准备四种指标的检测抗体混合液（抗体带sulfo-tag标记），加入板内进行孵育结合；

加入read buffer读板液上机读板检测，根据各个spot相应位置的光信号值，定量各检测指标的浓度。

通常MSD的U-PLEX试剂盒通过该方法实现多因子检测，可以在以下试剂盒中挑选感兴趣的因子，自由组合在一块板，实现多因子检测。

K15604K

U-PLEX Immuno-Oncology Group 1 (human) 131-Plex

APRIL/TNFSF13, BAFF-R/TNFRSF13C, BCMA/TNFRSF17, CD20, CD27, CD28, CD40L (soluble), CD276/B7-H3, C-Peptide, CTACK, CTLA-4, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, EPO, E-Selectin, FGF (basic), FGF-23, FLT3L, Fractalkine, FSH, Galectin-9, G-CSF, Ghrelin (active), GIP (active), GIP (inactive), GITR/TNFRSF18, GITRL/TNFSF18, GLP-1 (active), GLP-1 (inactive), GM-CSF, gp130 (soluble), Granzyme A, Granzyme B, GRO-α, HAVCR2/TIM-3, HVEM/TNFRSF14, I-309, ICOS, ICOS-L/B7-H2, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17C, IL-17D, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-29/IFN-λ1, IL-31, IL-33, Insulin, IP-10, I-TAC, LAG3, Leptin, LIGHT/TNFSF14, Luteinizing Hormone (LH), MCP-1, MCP-2, MCP-4, M-CSF, MDC, MIF, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-5, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 (total), Nectin-4, OX40/TNFRSF4, PD1 (epitope 1), PD1 (epitope 2), PD-L1 (epitope 1), PD-L1 (epitope 2), PD-L2, Pentraxin 3, Perforin, PlGF, PP, Proinsulin, proMMP-9, P-Selectin, PYY (total), RAGE (soluble), RANKL/TNFSF11, RANTES, S100A12, SDF-1α, Tie-2, TIGIT, TLR1, TNF-α, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A, VEGF-D, VEGFR-1/Flt-1, YKL-40

PLEX操作视频：

https://mp.weixin.qq.com/s/q0oB3zJ_PYzT6LfuUNu2Cg

四、电化学发光特点

·节约样本用量（25uL）

·高灵敏度（fg/ml）

·宽线性范围（5-6log）

·多因子检测（10因子）

·高重复性

·降低基质效应

MSD电化学发光仪器

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