衰老与离子通道：钾离子通道KV4在衰老过程中连接认知功能下降和心功能障碍

作者：Tommy Weiss Sadan博士和Melanie R. Grably博士

电压依赖性钾离子通道（KV4）在大脑和心脏中均有表达，它们调节认知功能和心脏输出量。衰老与心血管疾病和认知能力下降的趋势增加有关，但和这些衰弱性疾病之间的联系尚不明确。在这里，我们展示了KV4离子通道可能将心血管疾病和神经元功能障碍联系在一起，并展示了来自Alomone实验室的一系列功能工具来研究这种可能性。

 

简介

结构

钾离子通道是一个庞大而多样的蛋白超家族，通常根据其结构和激活方式进行分组。电压门控钾离子通道（KV）包含了这个蛋白超家族的很大一部分，并根据与其果蝇（Shaker、Shab、Shal和Shaw）的序列同源性进一步分为12个亚家族。Shal型钾离子通道也称为KV4.1、KV4.2和KV4.3（哺乳动物），在大脑和心脏中高度表达，分别调节神经元兴奋性和心脏起搏等多种生理功能。在衰老及其相关疾病的背景下，本文将主要关注这些类型的钾离子通道。

Shal型钾离子通道与其他钾离子通道具有相同的原型结构，如细胞质羧基末端、T1组装结构域、6个α螺旋跨膜结构域（S1-S6）和孔环（P-Loop），对钾离子具有选择性。螺旋状的S4区段在其他S亚基中是独特的，因为它被认为是电压传感器，由带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基密集簇构成。膜去极化时，S4结构域介导蛋白质构象的改变，并为钾离子通路打开通道。

KV离子通道活性的调控是一个复杂的多步骤过程，取决于许多因素，包括蛋白-蛋白相互作用、细胞信号事件、转录和翻译后活动，下文将详细说明。

 

转录调控

KV4的表达受多种因素影响，包括转录活性的变化。Argenziano等人发现睾酮控制着心脏中KV4.3的表达。作者使用 Anti-KV4.2 Antibody (#APC-023，Alomone)发现，非那雄胺和氟他胺（通过不同机制阻止雄激素信号转导的药物）会降低大鼠右心室中KV4.3的表达，这表明睾酮和雄激素信号转导在钾离子通道表达中发挥作用。

Micro RNA（miRNA）miR-223-3p在急性心肌缺血（AMI）大鼠模型中高表达/上调。使用Anti-KV4.2抗体（#APC-023）进行WB实验分析表明，miR-223-3p的表达与KV4.2的表达成反比。通过在原代新生大鼠心室肌细胞中表达miRNA，测试并验证了miR-223-3p负向调节KV4.2表达的可能性。事实上，miR-223-3p对KV4.2的抑制被Antagomir沉默miR-223-3p12所取消。miR-223-3p对KV4.2的影响似乎是特异性的，因为其他KV离子通道（即KV4.3）的蛋白水平没有被miRNA改变。

在神经系统中，裂解的GLP-1肽可刺激海马神经的长期电位（LTP）信号。使用Anti-KV4.2抗体对海马裂解液进行的WB实验分析表明，小鼠长期服用GLP-1（9-36）后，该蛋白的表达量减少，这与LTP信号的增加有关。

 

亚细胞运输和定位

钾离子通道的空间分布对细胞的正常功能非常重要。对于神经元等结构复杂的细胞来说尤其如此。最近有人研究了离子通道在调节KV4离子通道分布中的可能作用。使用抗KV4.3抗体对海马组织匀浆的细胞膜/膜部分进行WB实验，结果显示TRPC6的敲除导致细胞膜相关KV4.3的减少和细胞膜蛋白丰度的增加。此外，使用Anti-KV4.3抗体对大鼠脑切片进行免疫组化染色显示，给予TRPC6 siRNA的大鼠在齿状回细胞和副发光素（PV）阳性GABA能中间神经元中的KV4.3集群减少（图1），支持TRPC6可能在调节KV4.3亚细胞分布中的作用。

 

图1.TRPC6 siRNA对KV4.3定位的影响。

 

使用Anti-KV4.3抗体（#APC-017）对大鼠脑切片进行免疫组化染色。在对照条件下（上图），KV4.3染色（绿色）在GABA能神经元中强表达，并与parvalbumin免疫染色（红色）共定位。在TRPC6 siRNA的作用下（下图），KV4.3在树突中的分布明显减少。

经Frontiers公司许可，改编自参考文献9。

研究表明，糖蛋白Nectin-2α和KV4.2之间的新型相互作用可使KV4.2定位到胆碱能神经元相邻体节的特化质膜区域。使用Anti-KV4.2抗体进行高分辨电子显微镜观察证明了这种相互作用。此外，小鼠Nectin-2α的基因消减减少了胆碱能神经元顶膜的KV4.2荧光信号，证实了Nectin-2α-KV4.2的相互作用对KV4.2的定位非常重要。

 

KV4通过翻译后修饰调控

糖基化是一种常见的翻译后修饰，对许多生物过程都很重要，包括蛋白质在内质网（ER）中的折叠和蛋白质向质膜的转运。最近，Endie等人研究了水杨酸（一种带负电的糖）修饰对小鼠心室肌细胞KV离子通道的影响。为了研究潜在的机制，作者使用抗KV4.2抗体和抗KV1.5 (KCNA5)抗体（#APC-004）通过WB实验比较蛋白表达。尽管蛋白表达没有明显变化，但作者认为KV离子通道的硅酸修饰是微调KV离子通道活性的关键步骤。

 

KV4相互作用蛋白

KV离子通道活性的多样性可受蛋白-蛋白相互作用的影响。例如，Turnow等人证明KV4.3- DPP10a相互作用调节瞬态钾电流（Ito）。他们使用免疫荧光技术，利用抗KV4.3抗体在人心房肌细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）中提供了KV4.3-DPP10a共定位的证据。此外，他们使用功能测试证明了这种相互作用与生理相关，因为在CHO21中没有DPP10a时钾电流是不可见的。

同样，Wang等人使用Anti-KV4.2抗体在大鼠新皮质脑切片和嗅球中证实了KV4.2-KChIP3-DPP10a之间的相互作用，并认为该蛋白复合物介导体内阈下钾电流。

 

心血管疾病中的KV4离子通道

钾离子通道调节正常心脏功能的电驱动力。特别是，它们起到恢复膜极化和平衡钠离子和钙离子等去极化离子的作用。

心肌肥厚是对心功能不全的一种适应性反应，在心肌肥厚后经常观察到心脏电活动受损。M3毒蕈碱受体是胆碱能受体的成员，支配心脏细胞并控制其电功能。Chen等人研究了M3过度表达是否能减轻心脏肥大后的不良电信号。为了验证这一假设，作者产生了过度表达M3毒蕈碱受体的转基因小鼠。使用Anti-CHRM3 Antibody（#AMR-006），作者通过WB实验证实了M3受体的过度表达，并观察到心脏电活动在横主动脉收缩模型后与假对照组相当。为了确定M3过度表达恢复心脏功能的潜在机制，作者检查了各种离子通道的表达，这些离子通道控制钾离子的流出，因此有可能重建正常的心脏节律。他们发现，M3毒蕈碱受体提高了Kir2.1的表达，但使用抗KV4.3抗体测定的KV4.3没有变化。

最近，一项在中国人群中进行的基因调查发现，KV4.3基因（KCND3）中的一个错义突变与心房颤动（房颤）有关。该突变导致KV4.3蛋白中的Thr 361置换为Ser（Thr→Ser）。为了深入研究导致心房颤动的机制，Huang等人在HEK293T细胞中表达了野生型KV4.3或其突变对应物以及KChIp2。利用该系统，他们发现Thr→Ser突变增加了KV4.3的总表达量并增加了其膜定位，这是用抗KV4.3抗体进行WB实验测定的结果（图2）。此外，作者测量了钾电流，发现Thr→Ser与KV4.3的功能增益有关。

 

图2.带有缺义突变的KV4.3的细胞表面表达。

 

转染野生型（WT）KV4.3或KV4.3（T361S）突变体的HEK 293细胞的WB实验分析。用抗KV4.3抗体（#APC-017）免疫检测细胞表面KV4.3显示，与WT相比，突变体的细胞表面表达增加。Integrin α5用作负载对照。

经Impact Jourals许可，改编自参考文献8。

相反，Cheng等人证实，KV4.3在心肌细胞中过度表达可保护小鼠免于心力衰竭。具体而言，作者使用抗KV4.3抗体显示了KV4.3表达升高与钙调素依赖性蛋白激酶（CaMKII）磷酸化降低之间的联系，并认为这种保护作用是由于钙平衡所致。

最近的研究发现了KV相互作用蛋白中的新型突变，这些突变可对心脏功能产生削弱性影响，如引起心律不齐的Brugada综合征。因此，Portero等人发现了与该综合征相关的KVβ2突变。使用体外表达系统，作者能够证实Arg到Gln的置换并不影响KV4.3的表达，正如使用Alomone实验室的相应抗体进行WB实验所看到的那样，而是以一种尚未发现的方式影响心脏电生理学。

同样，Tsai等人在台湾人群中发现KChIP1拷贝数变异是房颤的强遗传预测因子。为了研究KChIP1如何参与房颤，作者使用Anti-KChIP1 (KCNIP1)抗体（#APC-141）在成年大鼠心脏中进行蛋白-蛋白相互作用研究，并使用抗钾离子通道KV4.2和KV4.3抗体或抗钙离子通道CaV1.2 (CACNA1C)抗体（#ACC-003）进行再检测。出乎意料的是，没有检测到这些蛋白，这表明KChIP1调节心脏性能的机制不同。作者尝试了一种基因方法，在心房细胞系HL-1中沉默KChIP1，发现钾离子电流和膜去极化发生了显著变化，表明KChIP1本身调节钾离子外向电流。

 

神经元功能障碍中的KV4离子通道

衰老导致的认知能力下降与海马中CA1和CA3锥体神经元功能失调有关。Simkin等人推测，导致老年大脑认知能力下降的CA3锥体神经元发射增加可能是由KV离子通道引起的。给予Phrixotoxin-1（#STP-700），一种选择性和强效的KV4.2和KV4.3离子通道阻断剂，可显著改善老年大鼠CA3神经元的电生理活性（图3）。其他结果表明，KV4.2抑制可能会延缓衰老过程中的神经退行性过程。

 

图3.Phrixotoxin-1抑制KV4.2和KV4.3可逆转衰老相关的快速过极化。

 

老化（红色）和年轻（蓝色）CA3神经元单个正向诱发动作电位的代表性轨迹，记录吸管中含有（虚线）和不含（实线）1 µM Phrixotoxin-1 (#STP-700)（PaTx）（从AP阈值开始）。PaTx处理将老化CA3神经元的快速后超极化（fAHP）降低到与年轻神经元相似的值。

经神经科学学会许可，改编自参考文献17。

帕金森病是渐进性神经退行性过程的另一个例子，α-突触核蛋白的蓄积可损害脆弱的神经元，如黑质（SN）多巴胺能神经元。在α-突触核蛋白A53T突变的基因工程小鼠中，观察到SN多巴胺能神经元（DA）选择性的高发射率。与体内模型类似，从突变的α-突触核蛋白DA神经元中分离出的神经元显示出更高的发射率，其模式表明起搏器电流发生了变化。电压门控的KV4离子通道先前被证明可控制多巴胺能神经元的起搏。应用特异性KV4离子通道阻断剂Phrixotoxin-2（#STP-710）完全阻止了对照组和α-突变体神经元之间电生理记录的差异（图4A）。此外，使用Anti-KV4.3抗体对小鼠脑切片进行免疫组化染色显示，KV4.3在α-突触核蛋白突变小鼠的黑质中表达更高（图4B）。这表明KV4活性或表达的改变是这种表型差异的基础。

 

图4.KV4.3在α-突触核蛋白突变小鼠DA神经元中的表达增加。

 

使用Anti-KV4.3抗体（#APC-017）对小鼠脑切片进行免疫组化染色。A. KV4.3在α-突触核蛋白突变小鼠黑质DA神经元中的表达增加（右下图）。B. α-突触核蛋白突变小鼠腹侧被盖区DA神经元中KV4.3的表达不增加（右下图）。

经神经科学学会许可，改编自参考文献19。

不同类型的细胞对α-突触核蛋白水平升高的反应不同。例如，迷走神经背运动核（DMV）可耐受高水平的α-突触核蛋白，与SN多巴胺能神经元相比，其凋亡程度较轻。此外，α-突触核蛋白的积累会改变SN多巴胺能神经元的电活动，但对DMV神经元没有明显影响。与野生型相比，α-突触核蛋白A53T突变的小鼠脑切片免疫组化染色显示出相似的KV4.3水平和表达模式。

 

研究KV4离子通道的药理学方法

在过去的十年中，靶向KV4离子通道的小分子/肽抑制剂的清单已大幅增加。现在可以利用这些工具发现KV4离子通道参与的新功能和生物过程。例如，Phrixotoxin-1和AmmTx3 Toxin（#STA- 305）针对KV4.3和KV4.2的多肽毒素阻断剂被用于研究毒素瞬态钾离子电流如何影响前Botzeiger-1型神经元节律性及其对呼吸的影响。

类似地，特异性KV4.2阻断剂Heteropodatoxin-2 (#STH-340)被用于揭示第5层锥体神经元丛树突突触可塑性的新机制，丛状树突的低频电刺激会诱发长期增强活动。

 

参考文献

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