外周血单个核细胞攻略

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）是外周血（即除骨髓以外的血液）中具有单个核的细胞的混合细胞群体，包括自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、T淋巴细胞(70%-90%)、B淋巴细胞。能够进一步分离纯化，是免疫细胞的主要来源。

 

表1 PBMC组分及占比

组分	占比
单核细胞	10-30%
淋巴细胞	70-90%
T淋巴细胞（CD3+)	45-70%
CD4+T淋巴细胞	CD3+T淋巴细胞的25-60%
CD8+T淋巴细胞	CD3+T淋巴细胞的5-30%
B淋巴细胞	5-15%
自然杀伤细胞	5-10%
树突状细胞	1-2%
干细胞	0.1-0.2%

 

单核细胞（monocyte）是血液中最大的白细胞，来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞，与各种细胞因子一起培养，可定向分化为巨噬细胞或树突状细胞等。注意不要把单个核细胞和单核细胞两者的概念混淆。

（图1）单核细胞（左）和淋巴细胞（右）

 

PBMC是免疫系统的关键组成部分,作为免疫学、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗等方向最基础的实验原料被广泛使用。分离外周血单个核细胞成为了免疫细胞研究的基础，外周血单个核细胞比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。这样利用介于两者比重之间的溶液做密度梯度离心，就可得到单个核细胞。最常用的是聚蔗糖和泛影酸钠混合比重为1.070±0.001的溶液，国内常用泛影葡胺代替泛影酸钠。

（图2） PBMC分离提取示意图

 

PBMC分离提取操作步骤：

1.用无菌稀释液将血样稀释2-4倍。

2.在50ml锥底离心管中先加入15-20ml分离液，然后缓慢加入20-30ml经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上。（适当增加分离液的使用量，将有利于提高单个核细胞纯度）

3.室温400g离心15-30min，保证转子速度平稳下降。

4.将离心管小心地从离心机中取出，缓缓地吸去最上层，避免接触单个核细胞层。

5.将单个核细胞层缓慢转移到另一支50ml锥底离心管中。

6.加入无菌洗涤液并混匀后，室温下300g离心10分钟，小心弃掉上清。

7.为了去除残余血小板，可将细胞重悬于30-50ml无菌洗涤液中，室温200g离心10-15min，小心弃掉上清。

8.可选择地重复第7步，将会去除绝大部分血小板。

9.将细胞用缓冲液或培养基重悬后进行检测、培养等后续操作。

 

此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的比重。

 

（图三）分离培养的PBMC

 

PBMC激活：

PBMC一般需要加细胞因子刺激，否则很快就会凋亡。推荐使用包被法

① 六孔板 5μg/mL CD3 800μL（室温2h 或 4℃过夜）

② 加入 RPMI-1640培养基（abs9484）+优级胎牛血清（abs972）+1μg/mL CD28+100IU/mL IL-2，细胞密度建议1-2×10⁶/ml, 刺激2-3d

细胞因子浓度、种类及细胞数量可根据自身实验目的调整。

 

PBMC冻存：

10% DMSO（abs9187）+FBS（abs972）

1.制备含20% DMSO的FBS溶液，置于冰上，（100%DMSO在冰上会形成冰晶）

2.确保PBMC为单细胞悬液。300 ×g离心10分钟，弃上清。

3.按1 - 20 ×10⁶ cells/mL的浓度将PBMC重悬于预冷的FBS中。

4.按1:1的比例将细胞和含20%DMSO的FBS混合。快速将1 mL的细胞悬液转移到冻存管。

5.将冻存管立即放入梯度降温盒中，在-80℃的冰箱中放置过夜后立即转入液氮。

 

PBMC离体之后越快冷冻越能保证其活性及功能。当全血离体一段时间后，再使用Ficoll进行分离，中性粒细胞会被活化，从而严重影响密度梯度离心得到PBMC的效率，从静置24h后的模拟运输环境中分离得到的PBMC，其组分中T细胞和NK细胞含量会发生明显变化，对刺激的反应也会弱化。

今天的文章就到这里啦，PBMC还有很多相关实验，感兴趣的可以期待下次讲解。

 

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注：文中图片来自网络，仅供学习参考用

 

参考文献：

Gebauer B S, Hricik D E, Atallah A, et al. Evolution of the enzyme‐linked immunosorbent spot assay for post‐transplant alloreactivity as a potentially useful immune monitoring tool[J]. American journal of transplantation, 2002, 2(9): 857-866.