免疫细胞（immune cells）是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。免疫细胞疗法，即通过采集身体中的免疫细胞，经过体外培养，扩增，最后回输到体内，来增强机体对疾病的抵抗能力。因此免疫细胞培养至关重要。为此，小优创建了《免疫细胞培养通关技巧合集》，将为大家详细地介绍免疫细胞培养的六个基本流程：样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。今天我们先一起学习样本制备！
首先，我们需要认识一下免疫细胞。按照来源，免疫细胞可分为髓系和淋巴两类。骨髓是各类血细胞（包括免疫细胞）的发源地，骨髓中的造血干细胞具有高度自我更新能力和多能分化潜力，在骨髓造血微环境的影响下，经过定向祖细胞。前体细胞等分化阶段，最终分化成熟为各种血细胞（包括免疫细胞）（图1）。了解免疫细胞的分化历程及相关的细胞因子是十分重要的，有助于我们在扩增&培养阶段根据细胞的类型添加不同的生长因子，从而满足细胞的营养需要。
图1 免疫细胞的分化历程及相关细胞因子（图片来源于网络）
除此之外，我们也要了解免疫细胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例，如此，我们才能选择目的免疫细胞相对富集的样本进行单细胞悬液的制备。以下列举了人外周血，小鼠脾脏、外周血和淋巴结中免疫细胞的比例，供大家参考（表1和表2）。
表1 人外周血免疫细胞的比例
表2 小鼠脾脏、外周血、淋巴结免疫细胞的比例
做好以上的知识准备后，就来到我们的样本制备啦！
在正式的样本制备之前，我们还需进行样本采集和预处理。根据目的免疫细胞的分化以及血液和免疫器官分布，选择合适的样本，新鲜取材，并进行相关的预处理。
血液：从血液中制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。采集血液样品后，要装入含适当抗凝剂的容器中防止凝集，并且血液要与抗凝剂充分轻柔混匀。不同的抗凝剂其抗凝原理略有不同，小优也为大家整理了常见抗凝剂的原理及优缺点（表3）。目前来说，适合后续免疫细胞培养的抗凝剂是肝素抗凝剂。
表3 常用抗凝剂汇总
实体组织：实体组织的预处理相对简单，主要是组织的清洗。使用培养基或PBS等清洗组织上残留的血液，并剔除相关的结缔组织，整合过程中也一定要保证无菌。
注意事项：
①样本的取材一定要新鲜无菌，这样才能保证细胞的状态。
②血液要与抗凝剂轻柔混匀，剧烈晃动可导致溶血。
③血液采集后，需进行检测以保证质量及无菌。
样本制备（Sample Preparation）：免疫细胞的来源可分为血液和各种实体组织，由此，样本制备的方法则分为PBMC的制备和实体组织制备成单细胞悬液。
1、单个核细胞（PBMC）的制备方法主要是密度梯度离心，其原理为血液中各细胞成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的Ficoll分离液作密度梯度离心时，各成分将按密度梯度聚集。
具体步骤如下：
1.收集抗凝血，用PBS按照1:1的比例稀释，轻轻上下颠倒混匀；
2.在15 mL离心管中，先加入3 mL充分混匀的Ficoll液（1.077密度），再沿着管壁小心加入2 mL稀释后的血液，血液和Ficoll液分层明显为成功；
3.将样本小心转移到离心机，500 g离心25 min；
4.小心取出离心管，弃掉上层黄色的液体，吸取中间层的白色薄膜层，即为PMBC（如图2）；
图2 抗凝血中加入Ficoll后图示（左）；离心分层后图示（右图）
5.用10 mL PBS洗涤获得的PBMC，250 g离心10 min，弃上清；
6.重复洗涤一次并重悬细胞备用。
注意事项：
①Ficoll和血液（现取现用）在实验前恢复至室温，防止Ficoll低温时密度增加和红细胞低温时聚集，以减少PBMC被红细胞污染。
②离心倾倒收获细胞前，也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层，有助于减少细胞被血小板污染。
2、实体组织制备成单细胞悬液：传统的实体组织解离成单细胞悬液的方法有机械法、酶解法和化学法。小优也为大家整理了这三种方法的原理、适用范围及优缺点（表4）。
表4 组织制备单细胞悬液传统方法的区别
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言归正传，传统的组织解离方法也不是完全分隔的，比如机械法和酶解法就可以组合使用，接下来，我们以制备脾脏单细胞悬液给大家举个例子：
脾脏单细胞悬液制备具体步骤：
1.取PBS清洗、且去除过结缔组织的脾脏组织，放在含冰冷PBS的培养皿中，将脾脏组织剪成约10mm3小块；
2.使用研杵将组织研磨成单细胞悬液或加入终浓度为100 µg/mL的DNAse I，室温孵育5 min；
3.将上述混合物转移至15 mL离心管中，4℃，500g，离心5 min；
4.弃上清，加入10 mL PBS洗涤，重悬备用。
注意事项：
①机械法处理组织时，应尽量轻柔，以免过度损伤细胞。
②使用酶解法时，消化时间不宜过短或过长，过短组织解离不充分，过长则影响细胞状态。
有的小伙伴要问了，酶的种类那么多，我怎么选择呢？这里给大家推荐一个非常好用的网站https://www.worthington-biochem.com/tools-resources/tissue-dissociation-guide，大家根据自己的样本选择后，可再进行预实验确定最佳的酶浓度和孵育时间，拿走不谢！
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大家是不是觉得到这里样本制备就是万事大吉啦，当然不是，在大多数情况下我们都需要对获得的单细胞悬液进行质量优化，包括但不限于：去除死细胞、碎片、细胞团以及红细胞裂解等等。这部分的内容，各位小伙伴可以参考《工欲善其事，必先利其器---单细胞悬液质量优化》。
好啦，样本制备的内容就介绍到这里啦，下一个细胞分选，咱们不见不散！
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