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间充质干细胞 鉴定手册

时间:2023-10-20 16:52:40 浏览次数:1458

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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的多能成体干细胞,广泛存在于脐带、骨髓、脂肪、牙髓、月经血等组织,体外培养可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种类型的细胞。

 

(图1) The Mesengenic Process(图片来源于文献,仅供学习参考用)

 

MSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,能够释放出许多具有抗凋亡、免疫调节、促血管生成等功能的生物活性因子,可刺激组织器官再生,并且低水平表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子,不表达MHC-Ⅱ类分子,不易激活T细胞的免疫反应,具有低免疫原性。这些特点和功能使MSCs成为细胞治疗的首选,美国临床信息公示数据库显示,截止今年9月份,共有1583项MSCs的临床实验,研究主要集中于心血管疾病、新冠肺炎、骨关节损伤、自身免疫性疾病等。

(图2)MSCs研究者分布和MSCs研究热点

 

随着MSCs的研究如火如荼,不同的分离方法、营养体系随之而来,如何评判不同分离方法的MSCs获得率成为了一个难题,为了解决这个问题,2006年,国际细胞治疗学会的间充质和组织干细胞委员会提出了定义人类MSCs的最低标准:

 

1、MSCs在标准培养条件下必须具有塑料粘附性

MSCs具有异质性,不同物种,不同组织来源大小有所差异,例如猫脂肪来源MSCs脐带来源MSCs小,所以无法单一的从外观判定MSCs,但是几乎所有的MSCs都是贴壁生长,具有较强的贴壁能力,多数MSCs呈纤维细胞样生长,呈梭形或不规则三角形,胞质向外伸出突起。传代后细胞呈旋涡状排列生长。

 

(图3)人骨髓间充质干细胞(图片来源于网络,仅供学习参考用)

 

2.特异性表面抗原(Ag)的表达

通过流式细胞术测量,95%的MSCs群体必须表达CD105、CD73和CD90。此外,这些细胞必须缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA II类的表达(5/2%阳性)。

 

表1 MSCs特异性表面抗原的表达指标

 

 

3.在体外具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。

三系分化能力是MSCs最独特的鉴定MSCs的方法,向成骨细胞的分化可以通过用茜素红染色或von Kossa染色来证明,向脂肪细胞分化最容易通过油红O染色来证明,成软骨细胞分化通过阿利辛蓝或免疫组织化学染色来证明。

 

(图4)人MSCs成骨分化诱导 abs9453

(图5)人MSCs成脂分化诱导 abs9454

 

(图5)人MSCs成软骨分化诱导 abs9455

 

三系分化小问答:

1.如何解决成骨分化后细胞极易脱壁的现象?

  • 试剂盒内含有包被液,可在铺板前使用。
  • 分化时细胞汇合度不易过高,请按照说明书指示。
  • 多孔样品换液时应尽量分批迅速,避免细胞表面干涸,加液时手法轻柔,不能直接冲击皿底,换液时培养基必须复温。
  • 诱导过程中更换培养液时不要清洗,诱导结束后清洗时一定要轻柔,避免剧烈晃动。

 

2.成脂分化时细胞形态变差

  • 成脂时细胞汇合度一定要达到90%左右
  • 若用完全诱导培养基B时发现细胞状态变差,可以根据具体情况提前更换为完全诱导培养基C。
  • 诱导过程中无需清洗,诱导结束后清洗时一定要轻柔,避免剧烈晃动。

 

3.成软骨诱导后软骨球不悬浮或者软骨球碎裂

  • 细胞成软骨诱导离心时,推荐220g离心5min,具体情况可以调整,以细胞聚团为准,离心力过大软骨球不易悬浮,过小软骨球表面易分散。
  • 诱导后24 小时内避免摇动细胞沉淀,以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
  • 注意开关培养箱门时动作要轻柔,不要震动。

 

4.软骨球是否可以做冰冻切片?

  • 可以,做冰冻切片时固定后可以用蔗糖梯度脱水,若不及时切片染色,需用铝箔纸包裹,保存在-80℃。

 

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参考文献

[1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

[2] Caplan A I, Correa D. The MSC: an injury drugstore[J]. Cell stem cell, 2011, 9(1): 11-15.

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