分子技术#11：DNA甲基化全解析：发生位点、检测方法、研究现状

一、什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，通过共价键结合的方式将甲基转移到特定的碱基上，包括胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位及鸟嘌呤的G-7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC），从而在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。

DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。这种修饰可以作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。

注：CpG二核苷酸是由一个胞嘧啶（Cytosine）和一个鸟嘌呤（Guanine）通过磷酸二酯键连接而成的二核苷酸。

 

二、DNA甲基化的检测方法

1）亚硫酸氢盐测序（Bisulfite Sequencing）

亚硫酸盐测序是目前最常用的DNA甲基化分析方法之一。它通过将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），从而将胞嘧啶带转化为尿嘧啶带，进而检测DNA甲基化水平，而甲基化的胞嘧啶（C）不变；再选择性地PCR扩增亚硫酸氢盐处理后的DNA片段，然后进行DNA测序，最后将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。这种方法灵敏度高，可重复性好，适用于检测单个基因或少数基因的甲基化水平。

 

图1：甲基化示意图（图片来自网络）

 

图2：亚硫酸氢盐测序的技术路线

 

2）RRBS法

该方法使用亚硫酸氢盐处理和限制性酶切，以富集高甲基化的DNA片段。这种方法可以快速、有效地检测基因组中高甲基化的CpG位点。

 

3）WGBS法：

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）是一种高通量的方法，可以在全基因组范围内检测所有单个胞嘧啶碱基的甲基化水平。这种方法需要较深的测序覆盖度，以获得准确的甲基化数据。

 

4）免疫沉淀测序（MeDIP-seq）：

该方法使用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫沉淀，然后进行高通量测序。通过这种方法可以检测基因组中所有CpG位点的甲基化状态。

 

三、DNA甲基化的主要研究方向

1）基础研究：疾病发生发展方向

①癌症：许多肿瘤相关基因的甲基化程度发生变化，进而导致了基因的沉默或过表达。例如，在乳腺癌中，一些抑癌基因如BRCA1、TP53等常常发生DNA甲基化，导致基因表达降低或丧失，从而增加了肿瘤的风险。此外，DNA甲基化水平的异常也与肿瘤的恶性程度和预后密切相关。研究发现，高度甲基化的肿瘤组织，与较低甲基化的肿瘤组织相比，往往具有更差的生存期和更高的转移风险。因此，DNA甲基化在癌症的早期筛查和诊断中有着重要意义。

②心血管疾病：甲基化基因的表达异常和DNA甲基化水平的改变与高血压、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的发生密切相关。

③遗传性疾病：一些单基因遗传病如囊性纤维化、血友病等可以通过甲基化进行基因诊断。

④精神疾病：DNA甲基化也可能与精神疾病的发生有关，如孤独症、精神分裂症等。

⑤自身免疫性疾病：研究表明，DNA甲基化可能在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥作用。

 

2）医学转化研究：疾病标志物方向

①癌症检测：DNA甲基化是癌症研究的重要领域之一，许多癌症类型都存在独特的DNA甲基化模式。通过检测癌症组织的DNA甲基化状态，可以用于癌症的早期诊断、预后评估以及复发监测等。例如，在肺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种癌症中，通过检测某些基因的甲基化状态，可以预测患者的生存率和复发风险。

②遗传性疾病检测：DNA甲基化在遗传性疾病检测方面也有应用。例如，通过检测某些基因的甲基化状态，可以用于囊性纤维化、血友病等单基因遗传病的诊断和筛查。

③精神疾病检测：研究表明，DNA甲基化可能与精神疾病的发生有关，如孤独症、精神分裂症等。通过检测精神疾病患者的DNA甲基化状态，有助于深入了解精神疾病的发病机制，并为精神疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

④自身免疫性疾病检测：研究表明，DNA甲基化可能在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥作用。通过检测自身免疫性疾病患者的DNA甲基化状态，有助于深入了解这些疾病的发病机制，并为治疗提供新的思路和方法。

 

3）动植物育种与环境

1. 在动植物育种方面：

①基础研究：研究动植物物种的甲基化模式与其生长发育、抗病性、繁殖性能、早期胚胎发育、衰老等的关系。

②分子标记：利用DNA甲基化作为分子标记，可以辅助育种者筛选具有优良性状的动植物个体，如抗病、抗虫、高产等。

③基因组编辑：通过改变动植物基因组的甲基化模式，可以实现对特定基因的表达调控，进而改良动植物的性状。

2.在环境方面：

①植物修复：一些植物具有富集污染物质的能力，通过调控这些植物的甲基化状态，可以促进其对污染物的吸收和降解，实现植物修复。

②微生物降解：利用微生物降解有机污染物是治理环境污染的重要手段之一。通过调控微生物的甲基化状态，可以增强其降解污染物质的能力。

③分子生态学研究：利用DNA甲基化研究污染环境中的微生物群落结构、功能和演替规律，有助于深入了解污染环境的生态学特征，为污染治理提供理论依据。

 

四、常用好物推荐

分类	产品名	货号	用途
样本采集	Allprotect Tissue Reagent	76405	组织样本DNA、RNA、蛋白共保存
	PAXgene Blood DNA Tube (100)	761115	血液DNA保存管
核酸纯化	QIAamp DNA Mini Kit (50)	51304	用于分离基因组、线粒体、细菌、寄生虫或病毒DNA
	QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)	56404	用于从福尔马林固定石蜡包埋组织中纯化基因组DNA
亚硫酸氢盐转化	EpiTect Bisulfite Kit (48)	59104	用于甲基化分析的DNA的完全亚硫酸氢盐转化和清理
	EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit (50)	59826	从gDNA、FFPE、血液、细胞或组织样本进行超快、高效的亚硫酸氢盐转化
	EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit (50)	59824
预扩增	EpiTect Whole Bisulfitome Kit (25)	59203	用于亚硫酸氢盐转化的DNA的全基因组扩增，以进行PCR分析
测序	QIAseq 1Step Amplicon Lib UDI-A Kit (96)	180419	快速高效地制备用于NGS应用的DNA文库
	QIAseq FX DNA Library UDI Kit (24)	180477	为Illumina仪器制备全酶法全基因组和杂交捕获文库
	QIAseq Ultralow Input Lib UDI-A Kit (96)	180497	高度灵活的DNA文库制备，用于Illumina仪器的测序