一文读懂抗体选择最全指南，建议收藏！

今天是《抗体选择最全指南》专题的第二期，上期在《抗体小知识》中介绍了抗体相关的基础知识，本期会介绍关于一抗和二抗的选择原则，以及小优精心总结的“优选技巧”，大家一起来看看吧。

 

一抗选择三要素

一抗选择需要注意的是三点：目的蛋白、反应种属及实验方法

一、目的蛋白

1、确认抗体检测指标与目的蛋白一致

一个蛋白往往有多个不同的名称，所以务必要确认抗体的检测指标与目的蛋白一致，最简单的办法是比对uniprot ID，两者一致就没有问题。

 

2、确认抗体的灵敏度

如果检测的是内源性蛋白，还需要确认一下抗体的灵敏度。大部分情况下抗体都是检测内源性的，但有少部分抗体的灵敏度是外源的（transfected only），那么检测内源性蛋白的时候就可能会做不出来，这种情况投诉厂家也不会受理，所以在购买前务必要确认清楚。

 

二、反应种属

1、确认抗体的反应种属（Reactivity）包含实验样本种属

这个很简单，就是看说明书上的反应种属（reactivity）有没有包含待测样本的种属，如果检测人的样本，它写了human，那就可以做。

 

 

需要注意的是，有些同学会把样本种属和抗体来源宿主搞混，我们这里讲的种属是待检测的样本种属，在抗体说明书上标注为反应种属（reactivity），抗体的来源宿主是Source或者Host。

2、什么是预测可以检测的种属？

有一些说明书上会写预测会与哪些种属反应（Predicted to work with），这个数据一般是厂家根据蛋白同源性预测得来的，但没有做过验证，也不会有质保，如果买了这个抗体做不出来，厂家也不会受理售后投诉。

 

 

3、尽可能选择与样本不同种系物种的一抗

如果检测的是小鼠样本，那么一抗尽量不要选小鼠或者大鼠来源的，也就是source/host不要是鼠的，因为要避免二抗和样本里面的内源性免疫球蛋白发生反应，造成高背景。

4、样本种属稀有，没有验证过的抗体怎么办？

有些同学做的样本比较稀有，比如猪、牛等等，可能在市面上找不到已经验证过的抗体，怎么办呢？也是有办法的。可以先去查抗体的免疫原序列，拿它跟待测的蛋白做同源性分析，如果同源性比较高，建议是超过90%，那么可以尝试，但这种情况下做不出来厂家是没有质保的。同源性分析怎么做呢？视频见下方。

另外，有些品牌，例如CST的抗体免疫原序列属于商业机密不会公开，我们可以把自己的蛋白序列提供给他们，让他们的专家来帮我们分析同源性的情况，给出使用建议。

三、实验方法

确认抗体说明书上的实验方法（application）包含待做的实验。

如果做WB的话那就比较简单，application里面写了WB就行，如果目前只做WB，也建议选择实验方法比较多的抗体，因为如果后续要补其他实验的话就可以直接用，不用再买了。

如果要做免疫组化（IHC），需要注意样本类型厂家有没有验证过，样本类型一般会分为石蜡切片、冰冻切片或者细胞，厂家会把验证过的样本类型写在说明书上或者标注在图片下面。如果不是厂家验证过的样本类型，一般不会有质保。

  

 

下图我们列出了部分品牌的IHC/ICC/IF的质保范围。

 

 

敲黑板了，R&D systems公司的IHC抗体对样本和染色方法的包容性很强，标注了IHC，表示组织石蜡切片/冰冻切片，无论是酶染还是荧光染色都可以；如果标注了ICC/IF，表示细胞样本，酶染还是荧光染色都可以。

 

 

二抗选择四要素

二抗选择有四个要素，分别是需要与一抗的特性（来源、免疫球蛋白类型）对应，并且需要根据实验方法选择标记和分子形式，接下来我们一一来看，在选择二抗之前，我们先来看看二抗的名称解读。

 

 

一、一抗的特性

1、二抗的反应种属与一抗的来源宿主相对应

在前面介绍抗体小知识的时候我们提过，抗体的Fc段是结合二抗的区域。因此二抗识别的是一抗的重链恒定区，只与一抗的种属来源有关。如果一抗的来源是兔子，那么二抗选择识别兔子的（anti-rabbit）即可。

 

 

2、二抗需与一抗的免疫球蛋白类型对应

如果一抗是多抗，比如来源于兔、山羊等，并且是 IgG 同型，那么二抗一般选择抗 IgG(H+L)（重链和轻链）的。

如果一抗是单抗，来源为小鼠 IgG1，则可以选择Anti-Mouse IgG1的，或者是anti-mouse IgG(H+L)的二抗。一般选择后者，因后者的适用范围更广。

二、实验方法

1、根据实验方法选择偶联标记

根据实验方法和显色系统不同，来选择二抗的偶联标记，下表可供大家参考。

 

实验类型	显色系统	偶联标记
WB	ECL	酶（HRP/AP，HRP最常见）
	荧光	荧光标记物
ELISA	化学显色法	酶（HRP/AP）、生物素
IHC	Polymer	酶（HRP）
	ABC法、SP法	生物素
ICC	荧光	荧光标记物
	化学显色法	酶（HRP）、生物素
IF	荧光	荧光标记物

 

2、根据实验方法选择分子形式

(1)   大多数实验无特殊要求都可选择完整的全片段形式（二抗名称含H+L，双价）的抗体，例如以下几个：

货号	产品描述	实验方法	规格
7074	Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	WB	100ul/1ml/5ml
7076	Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	WB	100ul/1ml/5ml
111-035-003	Peroxidase AffiniPure™ Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	WB IHC Elisa	2 ml
115-035-003	Peroxidase AffiniPure™ Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	WB IHC Elisa	2 ml
abs20001	HRP conjugated Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody	WB IHC Elisa	100ul/500ul/1mL
abs20002	HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG h+l antibody	WB IHC Elisa	100ul/500ul/1mL

(2)   如果是做间标流式、或者用IHC/ICC/IF检测Fc受体表达丰富的样本（例如淋巴结、脾脏、外周血等），建议选择F(ab')2 片段形式（双价），因为这类二抗分子量较小，比较容易穿透组织，而且能避免与活细胞上的 Fc 受体结合，产生非特异性背景；

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	偶联标记	规格
115-546-003	Goat/Mouse	F(ab')₂ Fragment	Alexa Fluor® 488	0.75 mg
111-546-003	Goat/Rabbit	F(ab')₂ Fragment	Alexa Fluor® 488	0.75 mg

(3)   当用两只来源相同的一抗做IF双染实验，或者一抗与所研究组织种属来源相同时，则需要选择Fab 片段形式的二抗（单价）来封闭内源性的免疫球蛋白。

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	偶联标记	规格
115-007-003	山羊/小鼠	Fab片段	-	1.0 mg
115-547-003	山羊/小鼠	Fab片段	Alexa Fluor 488	0.75 mg
111-007-003	山羊/兔	Fab片段	-	1.0 mg
111-547-003	山羊/兔	Fab片段	Alexa Fluor 488	0.75 mg

 

3、什么是交叉吸附（预吸附）处理的二抗？

预吸附（又称交叉吸附）是额外增加的纯化步骤，目的是提高抗体的特异性。具体方法是，利用具有潜在交叉反应性的种属制备固定血清蛋白，让含二抗的溶液通过含有这种固定血清蛋白的基质柱。非特异性二抗会留在柱中，而通过基质柱的高特异性二抗会被收集下来。也就是说，经过交叉吸附（预吸附）处理的二抗，抗体特异性更高，非特异性结合更少。

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	偶联标记	减少交叉吸附的物种（min X）	规格
715-545-151	驴/小鼠	Whole IgG	AF488	Bov,Ck,Gt,GP,Sy Hms,Hrs,Hu,Rb,Rat,Shp Sr Prot	0.5mg
115-545-146	山羊/小鼠	Whole IgG	AF488	Hu,Bov,Hrs,Rb,Sw Sr Prot	1mg
111-605-144	山羊/兔	Whole IgG	AF647	Hu,Ms,Rat Sr Prot	1mg

 

这种二抗的应用主要有两种情况：

(1)   样本含有内源性免疫球蛋白时

如果待测样本含有大量的内源性免疫球蛋白，需要使用经过交叉吸附（预吸附）处理的二抗，减少二抗和内源性免疫球蛋白结合的可能。

例：样本为带有内源性免疫球蛋白的大鼠组织，而一抗为小鼠来源的，那么二抗需要选择Anti-mouse (H+L) 交叉吸附 rat的，因为大鼠和小鼠同源，二抗可能会与样本里的内源性大鼠蛋白有非特异性结合。

(2)   多色实验

在进行多色免疫组化、荧光多标或多色流式实验时，常会选择多个不同来源的一抗搭配相应二抗，同时进行检测。在这类实验中，体系内种属较多，应该使用经预吸附处理的二抗，以减少二抗发生非特异性结合的风险，降低染色背景。

例：样本为带有内源性免疫球蛋白的人源组织，做免疫荧光双染，一抗分别为mouse anti-X, rabbit anti-Y，那么二抗则需要选择Anti-mouse (H+L) 交叉吸附human、rabbit，以及Anti-rabbit (H+L) 交叉吸附 human、mouse的。

然而，在根据这些选择原则层层筛选之后，还会有不少抗体满足我们的实验需求，那么该怎么办呢？请看我们的“优选技巧”。

1、比较文献引用情况

同时有很多抗体都满足我们的实验需求的话，第一步可以看别人做的效果怎么样，如果发表过的文献多，那么这支抗体大概率是可靠的。可以直接在CiteAb网站（https://www.citeab.com/）上查询抗体的引用情况，也可以上厂家官网查看说明书。

 

 

2、比较说明书图片

第二步，我们可以参考抗体说明书上的结果图。例如下图，这两支抗体的反应种属和实验方法都类似，我们可以根据图片显示的结果情况二选一。

 

 

3、选择品牌的王牌产品线

目前市面上的很多抗体品牌，都推出了自家的王牌产品线。比如XP系列抗体就是CST应用专利技术生产的兔单抗系列产品，这个系列抗体的特异性、灵敏度、稳定性等都较普通单抗高。从说明书上看，它们的种属范围、适用实验范围会更广，而且实验效果更优，抗体稀释比例也更大，也就是性价比更高，所以一般建议优先选择王牌产品线的产品。

 

 

4、比较性价比

性价比可能是大家最关注的点之一，我们可以找到产品规格、稀释比例，计算使用总数和单次价格，最终选出单次价格最合适的那款。

 

 

例如这支抗体，规格100ul，WB的稀释比例是1:50000，原价2300。WB每张膜使用量按5ml计算，100ul*50000/5ml=1000张膜，单张膜价格为2.3元。

5、看品牌在领域的影响力

目前市面上抗体品牌非常多，很多品牌都有自己独特的优势和特色。我们在选择抗体的时候，一般尽量选择在这个领域更擅长、更有影响力的品牌。品牌在自己擅长的领域，产品线会更齐全，选择更多，而且专业资源会更多，经验也更丰富，我们能得到的支持也更多。下面我简单列举了一些品牌的擅长领域，供大家参考。

CST：信号通路金标准
BD：流式金标准
Bio-techne：Elisa及细胞因子金标准，全能抗体
MIltenyi：磁珠分选金标准，流式抗体
Jackson：二抗金标准
Absin：中国人自己的生命科学百宝箱，性价比高货期短
斯达特：诊断抗体、伴随诊断抗体
Alomone：膜蛋白专家
Santa cruz：产品齐全，性价比高
Cytoskeleton：细胞骨架抗体
Agrisera：植物抗体
Lifespan：高品质，少见指标抗体
SYSY：高品质，少见指标抗体
Atlas antibodies：高品质，少见指标抗体
Bioxcell：体内研究抗体

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注：文章内容来源于小优大学堂讲座《抗体选择最全指南》，点击此处观看讲座视频