答应我，看完再做ELISA（下）

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小伙伴们在上篇学习了ELISA实验的原理、类型，并且根据自己的需求选择了适合自己的试剂盒，那接下来就是ELISA的实操了，包括哪些实验步骤和注意事项呢？快来和小优一探究竟吧！（文末有好礼！）

 

ELISA实验步骤

 图3 ELISA标准实验流程

实验前准备：
1.   样本采集：
a)   血浆：采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30分钟内，1000xg离心15分钟。立即检测或分装后于≤-20℃储存。避免反复冻融。
b)   细胞培养上清液：通过离心去除颗粒，立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。避免反复冻融。
c)   细胞裂解液：在裂解缓冲液中裂解细胞并将其放在冰上静置30分钟。14,000xg离心5分钟除去不溶物。将上清液转移至新管中利用总蛋白分析法定量总蛋白浓度。立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。
d)   乏血小板血浆：在采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30分钟内，1000xg离心15分钟。建议在2-8°C下，10,000xg 再次离心10分钟，以便完全去除血小板。立即检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。
e)   血清：使用不含抗凝剂的收集管，让样品在室温下凝结30分钟，然后1000xg离心15分钟。立即取出血清并进行检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。
f)   唾液：将唾液收集到管中，10,00xg离心5分钟。收集水相，立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。避免反复冻融。
g)   尿液：无菌进行当天首次尿液的采集(中段尿)，直接排入无菌容器中。离心去除不溶颗粒物质。立即检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。
h)   母乳：2-8°C，1000xg 离心15分钟。重复进行水相部分的收集，总共3次。立即检测。
i)   组织匀浆液：制备方法因组织类型而异。用1XPBS缓冲液冲洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS进行匀浆，并于≤-20°C下储存过夜。将匀浆液冻融两次以便破坏细胞膜，然后5000xg离心5分钟。去除上清液后立即进行检测，或者分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。
j)   组织裂解液：用PBS冲洗组织，将组织切成1-2mm的薄片，用组织匀浆器在PBS中进行匀浆。加入等体积的含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，在室温下裂解组织30分钟，裂解过程中轻摇裂解液。离心去除沉淀。利用总蛋白质分析法定量总蛋白的浓度。立即检测或分装后于≤-20°C储存。
2. 预实验
ELISA实验中进行预实验是非常有必要的，一方面为了检测试剂盒是否好用，标曲拟合线性是否良好，最高OD值是否能达到2.0左右，是否存在假阳性假阴性；另外一方面为了检测样本最佳稀释比例，样本浓度过高要进行稀释；样本浓度过低要选择超敏试剂盒。
3. ELISA实验对照
a)   空白对照：提供背景信号参考，并确保读取值表示样品中的分析物浓度。
b)   阳性对照：已知含有目标蛋白的内源性可溶样品，或已知含有检测抗体免疫原的纯化蛋白或多肽来作为阳性对照。当样品的检测结果为阴性时，阳性对照的阳性结果可表明实验过程无误且有效，所以实验的阴性结果是真实的。
c)   阴性对照：已知不表达目标蛋白的样品。其有助于检测非特异性结合和假阳性结果。
d)   标准品：含有已知浓度的目标蛋白的样品，可从中获得标准曲线。
e)   样本基质中的标准品（加标对照品）：加标对照可用来给出有关某种特殊样品基质中分析物发现程度的信息，从而表明检测性能。比如，在 ELISA 中检测血清样品时，按照惯例标准品用正常稀释缓冲液来稀释。但可以同时用检测的种属血清来稀释标准品。
4.实验步骤（以Human IL-6 ELISA Kit – Quantikine，Catalog # D6050）
1. 使用前将所有试剂和样品置于室温。建议所有标准品、对照品和样品一式两份；
2.用不完的微孔板条可以移除，将它们放回含有干燥剂包装的箔袋中，并重新密封；
3. 每孔加入100 μL检测稀释剂RD1W；
4. 每孔加入100 μL标准品、对照品或样品，盖上盖子。室温孵育2小时。同时做好板布局的记录；
5. 弃去液体，使用400 μL洗涤缓冲液洗涤，重复三次，共洗涤四次。有条件的话可以使用自动洗板机，最后一次洗涤的时候，去除掉所有洗涤缓冲液后，把孔板倒置，用干净的吸水纸吸干；
6. 每孔加人IL-6检测抗体200 μL。盖上盖子，室温孵育2小时；
7. 重复步骤5中的洗涤；
8. 每孔加底物溶液200 μL，室温下孵育20分钟，避光；
9. 每孔加入50 μL反应停止液。并且能够观察到孔里的颜色从蓝色变成黄色。如果孔内颜色呈绿色或颜色变化不均匀，轻拍板以确保充分混合；
10. 在30分钟内测定每个孔的吸光度，设置酶标仪波长为450nm。如果有波长校正，请设置为540nm或570nm。如果波长校正不可用，可以用450nm读数减去540nm或570nm读数。

 

ELISA操作小技巧
 

图4 ELISA操作小技巧（图源于R&D）

ELISA常见问题

常见问题	原因	解决方法
无信号或信号低，但标准曲线正常	样本中无目标分子 或目标分子浓度低于试剂盒检测范围	更换可以检测浓度更低的试剂盒 或对样本进行浓缩
	样本中的基质效应干扰了目标蛋白与抗体结合	用适当的稀释液对样本进行浓缩梯度处理，检测稀释的线性度是否良好，设置加标对照品
标准品和样品都无信号或信号低	标准品问题 标准品毁坏（样品孔有信号） 标准品重溶方法是否正确	重新使用一瓶新的标准品 待标准品恢复室温后，按照说明书加入指定提及的稀释液，充分溶解15分钟
	显色试剂是否有效 显色时间不充足	进行color test 增加显色时间
	实验条件与操作问题	孵育温度，时间，是否需要振荡器，酶标仪是否设置正确等
信号强	样本中检测分子的浓度高，超出试剂盒检测范围	对样本进行适当的稀释
	洗涤不充分，残留有未结合的过氧化物酶	按照说明书进行充分洗涤（洗板机，增加洗涤次数）
	板孔有干掉的情况	洗涤和加样的过程中速度要快一些
	显色液、终止液未及时使用	显色液、终止液尽量现配现用
CV值高或者重复性差	洗板不规范导致washing buffer残留，使后加的反应试剂浓度不稳定	洗涤步骤严格按照说明书操作
	显色试剂不稳定 各板孔的抗体不稳定，不均一	尽量选择质量有保障的试剂盒
	实验温度问题	保持温度适当且无明显变化
	实验操作问题	严格要求操作细节

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参考资料：Bio-techne ELISA技术指南