不看后悔系列！全网最详类器官培养攻略

概述
随着大家实验对类器官模型的需求越来越多，类器官培养已经成为我们必备的一项实验技能。然而，类器官培养相对细胞复杂，诸多的细节需要注意，需要一个详细的流程来指导我们快速掌握类器官培养技术。不同种类的类器官培养步骤大同小异，因此我们掌握了通用方法，在不同类器官上适当调整操作步骤即可，今天小爱为大家奉上史上最详类器官培养攻略，不看遗憾一万年呐！！！

流程
类器官有多种培养方法，比如使用超低吸附培养板和生物反应器，基质胶法等，今天咱来讲一讲基质胶法。

 

类器官原代培养流程

原代（以人肠癌类器官为例）
一、准备工作
1、仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。
2.试剂耗材（以肠癌为例）
人肠癌类器官培养基试剂盒（abs9445），基质胶（低因子、无酚红）（abs9495），60mm细胞培养皿（abs7005）， 100μm滤筛（abs7009），15ml离心管（abs7102），1.5ml EP管若干（abs7119），24孔细胞培养板（abs7058）、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

 

人肠癌类器官培养基试剂盒（abs9445）	基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）

 

组分名称	规格
人肠癌类器官培养基 A	100ml
类器官原代培养缓冲液 B	250ml
人肠癌原代组织消化液 C	30ml
类器官传代消化液 D	30ml
组织保存液 E	100ml
类器官冻存液 F	20ml
类器官传代培养缓冲液 G	250ml

 

二、操作流程
1、样本准备
（1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液 E的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回。
（2）将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿样本拍照，并登记，大小，颜色，软硬程度，组织类型等信息。

 

 

2、清洗-剪碎
（1）在60mm细胞培养皿（abs7005）里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm³的组织块，转移至15ml离心管。

 

 

3、消化-过滤
（2）向15ml离心管中加入5倍人肠癌原代组织消化液 C（消化液体积：组织体积=5:1，如果估量组织体积困难，使用5mL消化液通常足够）在37℃进行消化15-30min（消化过程中随时观察消化情况）。
（3）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的细胞团（5-50个细胞抱团）后， 加入3倍体积原代培养缓冲液 B （缓冲液体积：消化液体积=3:1）终止消化，用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

 

 

（4）使用100μm滤筛（abs7009）进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml离心管，于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清。 

 

 

4、加胶-点板-加液（这里是整个原代操作的点睛之笔）
（1）准备工作
a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化
b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时
c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完

 

低温金属冰盒（abs7289）

 

（2）接种要求
24孔板（abs7035），每孔25ul基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液
（3）接种密度
密度建议1：基质胶体积：细胞团沉淀体积=25:1（如果估摸细胞团沉淀体积困难，通常加300uL基质胶足够）
密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）
（4）加胶-点板
向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495），进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。
（5）加液
将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μl人肠癌类器官培养基 A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-500um，可进行传代操作。

 

 

人结肠癌-10x铺板密度

 

传代（消化分两种情况）
一、类器官数量较多或体积较大传代步骤
1、类器官收集及洗涤
1）收集：移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在 15ml 离心管中(24孔板，每5孔为一组)。

 

 

2）洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14ml（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置 40min或-20℃放置5分钟（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。
3）接下来将离心管进行300g，4℃， 离心5min，离心完通常会有这两种情况：
第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：
a离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；
b离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10分钟）。
2、类器官消化
1）添加2-3mL类器官传代消化液D于超净台内消化2-3min，消化期间吹打1-2次。此步骤以消化成细胞团为主，千万不要消化成单细胞，单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜，可吸取数微升镜下观察，如果有较多细胞团可停止消化。
2）添加5倍类器官传代培养缓冲液G（缓冲液：消化液=5:1）终止消化，300g 4℃ 离心 5min 弃去上清（如果有基质胶残留，残留量<50ul正常，不影响传代类器官增殖）

 

 

3、加胶-点板-加液
（1）准备工作
a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化
b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时
c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完
（2）接种要求
24孔板（abs7035），每孔25ul基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液
（3）接种密度
密度建议1： 类器官通常按1:2传代，例如，24孔板收集5孔，传代10孔，需要的基质胶量25*10=250ul。
密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）
注意：不管是按密度建议1还是，密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍
（4）加胶-点板
向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495），进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。
（5）加液
将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μl人肠癌类器官培养基 A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200-300um，可进行传代操作。

 

 

二、类器官数量不足或体积较小时：
1、类器官收集、吹打、洗涤
1）移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶。
2）进行吹打，将类器官吹成细胞团（可取样镜下观察有较多细胞团时可停止吹打）；
3）洗涤： 24孔板，每5孔为一组，收集在 15ml 离心管中，加类器官传代培养缓冲液G定容至14ml（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置 40min或-20℃放置5分钟（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。
4）接下来将离心管进行300g，4℃， 离心5min，离心完通常会有这两种情况：
第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留细胞团沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶细胞团混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶细胞团混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：
a离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；
b离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10分钟）。
2、加胶-点板-加液
（1）准备工作
a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化
b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时
c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完
（2）接种要求
24孔板（abs7035），每孔25ul基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液
（3）接种密度
密度建议1： 对于类器官数量较少的情况，为了维持生长所需的旁分泌信号，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，铺3孔，需要的基质胶量25*3=75uL。
密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）
注意：不管是按密度建议1还是按密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍
（4）加胶-点板
向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495），进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。
（5）加液
将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μl人肠癌类器官培养基 A进行培养。大概7-10天，多数类器官直径在200-300um，可进行再次传代。

 

冻存
冻存要领:
类器官不需要消化（消化后的类器官复苏活率低）；
在类器官指数增长期冻存（等到该传代的时候类器官活性比指数期差），也就传代后的Day3-Day4，多数类器官直径在100um-200um，这个时机选择冻存。
一、类器官收集及洗涤
1、收集：移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在 15ml 离心管中(24孔板，每5孔为一组)。

 

 

2、洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14ml（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置 40min或-20℃放置5分钟（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。
3、接下来将离心管进行300g，4℃， 离心5min，离心完通常会有这两种情况：
第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：
a离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；
b离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10分钟）。
二、类器官冻存
1、冻存密度，以24孔板为例
密度建议1：2孔/mL 冻存液
密度建议2：500个类器官/mL 冻存液（如果想计数冻存，可以参照此密度建议）
2、添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，建议立即进行冻存。（放置太久，DMSO对类器官有损伤）
3、梯度冻存：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。
   手动冻存：4℃冰箱放置30 min，转移至-20℃放置1 小时，然后移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

 

复苏
一、实验前准备
1、将水浴锅预热至37℃；
2、细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面；
3、在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。
二、取出冻存管
1、根据类器官冻存记录按标签找到所需类器官的编号。
2、从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。
三、迅速解冻
1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中地液体迅速融化。
2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁，再拿入超净台内。
四、将类器官冻存液移入15ml离心管，添加10倍体积类器官传代培养缓冲液 G（缓冲液体积：冻存液体积=10:1）重悬，轻柔吹打混匀，300g 4℃ 离心 5min，弃上清。
五、加胶-点板-加液
1、准备工作
（1）基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化
（2）枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时
（3）融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完
2、复苏要求
24孔板（abs7035），每孔25ul基质胶类器官混合物，500-750uL类器官培养液
3、复苏密度
复苏密度建议1：1:1接种（原来冻几孔就复苏几孔）
复苏密度建议2：250个类器官/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）
4、加胶-点板
向类器官沉淀加入基质胶（abs9495），进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。
5、加液
将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μl人肠癌类器官培养基 A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-500um，可进行传代操作。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！
注：文中部分图片源于客户提供，感谢支持！如有侵权，联系删。

 

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