揭秘：如何高效检测蛋白质聚集

蛋白质聚集（Protein Aggregation）是蛋白质发生错误折叠、构象改变而形成聚体的生物学现象。在生产、运输和储存的过程中，多种因素都能导致蛋白质发生聚集，是目前生物制药领域面临的核心难题之一。以单克隆抗体(mAb)药物为例，蛋白质聚集不仅会干扰给药剂量的精确性，还可能导致蛋白质失活，引发非预期的免疫反应，危及治疗安全。因此，严格监控mAb的聚集状态，可以评估产品的稳定性，从而优化配方和制造过程，对于确保产品质量及患者安全至关重要。

 

常用于检测蛋白质聚集的方法包括超速离心、尺寸排阻色谱、凝胶电泳、动态光散射及浊度测量等，往往较为繁琐，且并非适用于所有蛋白质，在实际应用中常常受到挑战。PROTEOSTAT®系列产品采用独特的分子转子染料（molecular rotor dye）检测蛋白质的聚集，其发光特性依赖于分子内部的旋转运动。当染料分子被限制在紧密的空间内，如蛋白质聚集体内部时，其旋转受阻后荧光强度增加，用仪器检测荧光强度的变化即可实现对蛋白质聚集体的精准检测。

 

图1：PROTEOSTAT®荧光较其他荧光信号强度更高

该系列试剂盒有以下特点：

即用型，不含放射性同位素，一步法，操作简便
高灵敏度，灵敏度与3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法相当
不需溶解步骤即可实现高通量检测

 

一、蛋白质聚集检测试剂盒（PROTEOSTAT® Protein aggregation assay）——定量/半定量检测从可见颗粒到亚可见颗粒的蛋白质聚集体

 

使用PROTEOSTAT®试剂盒，将样本与荧光染料混合。在存在蛋白质聚集的情况下，染料与聚集体结合并发出荧光信号，该信号可以通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光板读取器等设备进行检测和定量。通过测量荧光信号的强度，可以评估蛋白质聚集的程度。

这种方法的优势在于其高灵敏度、快速简便，且不需要复杂的样品处理步骤，适用于多种类型的蛋白质聚集体检测。

品名	货号	规格
PROTEOSTAT® Protein aggregation assay	ENZ-51023-KP002	2 x 96-well tests or 70 flow cytometry tests
	ENZ-51023-KP050	50 tests in a 96 well plate or 16 flow cytometry tests

主要应用：
1. 检测溶液中的肽和蛋白质聚集
2. 确定保持蛋白质稳定性的最佳储存条件
3. 筛选能够促进或抑制蛋白质聚集的化合物
4. 高灵敏度测量分子伴侣的活性

 

应用示例1：样本经5FU处理，与PROTEOSTAT®染料孵育后，用流式检测蛋白质聚集情况。
 

图2：Cell Death Dis. 2023 Jan 30;14(1):71. doi: 10.1038/s41419-023-05559-9. PMID: 36717548; PMCID: PMC9887066

应用示例2：应用PROTEOSTAT®验证HSC70 的分子伴侣功能

 

图3：Biochem Biophys Rep. 2022 Dec 21;33:101414. doi: 10.1016/j.bbrep.2022.101414. PMID: 36590871; PMCID: PMC9800270.

产品特点：
1. 操作步骤简便、均相
2. 可检测蛋白范围广
3. 荧光强度高
4. 提供至少两个数量级的线性动态范围
5. 适应的pH值范围广泛（4至10）
6. 兼容多种缓冲液
7. 灵敏度达到亚微摩尔级别，在浓缩蛋白质溶液中可检测低至1-5%的蛋白质聚集体。
8. 建议搭配下述PROTEOSTAT® Protein Aggregation Standards kit (货号 ENZ-51039)，可对蛋白质聚集体进行定量分析

 

可用平台
流式细胞仪、荧光显微镜、荧光检测微孔板

 

实验步骤
Step 1 每孔加2 µL of PROTEOSTAT® detection reagent
Step 2 加 98 µL蛋白 (1 µg/mL – 10mg/mL)
Step 3 室温避光孵育15分钟
Step 4 上机检测（ex: 550 nm / em: 600nm） 

 

试剂盒包含：
PROTEOSTAT® detection reagent
PROTEOSTAT® positive control
PROTEOSTAT® negative control
10X PROTEOSTAT® assay buffer

二、独家蛋白质聚集检测标准品——PROTEOSTAT® Protein aggregation standards

 

PROTEOSTAT® Protein aggregation standards是稳定、高质量的标准品，用于生成标准曲线。重悬后样品中聚集蛋白含量分别为12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%、0.39%、0.20%和0%，各标准品总蛋白浓度保持在1mg/ml。IgG标准品的总蛋白浓度已与内部蛋白标准品直接比较进行校准，以确保批次间的一致性和准确性。已经正交表征方法，包括基于激光的纳米颗粒跟踪和微流成像，验证单体的完整性。

品名	货号	规格
PROTEOSTAT® Protein aggregation standards	ENZ-51039-KP002	2x96 wells

 

产品特点：
1. 稳定且已知浓度的高质量IgG
2. 与前述PROTEOSTAT® Protein Aggregation Assay（货号ENZ-51023）搭配使用，可对蛋白质聚集体进行定量分析
3. 即用型产品，只需加水即可使用

 

图4：使用PROTEOSTAT® Protein Aggregation standards绘制的标准曲线参考图

可用平台：荧光检测微孔板

 

三、蛋白重折叠与聚集检测试剂盒（PROTEOSTAT® Protein refolding and aggregation sensing kit）确定蛋白质最佳重折叠条件，最大限度地回收功能蛋白质

 

微生物宿主过量表达真核蛋白时，常导致包涵体中形成不溶性蛋白质聚集体。通常对蛋白质进行溶解和重折叠，可使其恢复到原生状态。蛋白质在溶液中的折叠受到许多理化参数的影响，包括离子强度、pH 值、温度、氧化状态和蛋白质浓度等，为了避免产生不必要的非途径产物，采用的主要策略是连续或不连续地更换缓冲液。PROTEOSTAT® Protein Refolding and Aggregation Sensing Kit使用独有染料监测蛋白质聚集，用简单、均相的检测方法，筛选特定蛋白质在不同缓冲液中的重折叠参数。

品名	货号	规格
PROTEOSTAT® Protein refolding and aggregation sensing kit	ENZ-51040-KP002	2x96 wells

 

主要应用
检测特定蛋白质在不同缓冲液中的重折叠参数，确定蛋白质最佳重折叠条件，最大限度地回收功能蛋白质。

 

应用示例：利用PROTEOSTAT®试剂盒检测溶菌酶在不同缓冲液的重折叠参数，确定最佳重折叠条件

 

图5 将变性溶菌酶按比例稀释到各种重折叠缓冲液中，用PROTEOSTAT® 试剂盒检测荧光强度。经测定 13B 具有高活性和低荧光，因此选择 13B 来评估辅料对溶菌酶重折叠的影响。
 

 图6：将辅料分别加入具有 GSH/GSSG 环境的折叠缓冲液中，并分析其聚集和活性。结果表明，MgCl2 在 13B 重折叠缓冲液中促进重折叠的效果最好，聚集倾向最小。

 

产品特点
1、 使用PROTEOSTAT®独有染料，荧光亮度更高
2、 即用型试剂盒，实验流程已优化
3、 实验操作简便高效

 

可用平台
荧光显微镜、流式细胞术、酶标仪、高内涵筛选HCS和高通量筛选HTS

 

四、热位移稳定性检测试剂盒（PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit）——确定蛋白质稳定性与温度、pH、离子强度和浓度等的关系

 

PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit包含独有的荧光染料，可用于监测系统热应力条件下的蛋白质稳定性。

品名	货号	规格
PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit	ENZ-51027-K400	400 tests
	ENZ-51027-K100	100 tests

 

图7：山羊抗小鼠 IgG（11.2 mg/ml，pH 7.4）的 PROTEOSTAT® 热位移稳定性检测的典型结果。

主要应用

1. 通过热位移实验，确定蛋白质聚集的温度
2. 优化条件，最大限度地减少蛋白质的聚集
3. 筛选与相关蛋白质结合并增强其结构稳定性的配体
4. 与前述PROTEOSTAT® Protein refolding and aggregation sensing kit (货号ENZ-51040) 搭配使用，可确定蛋白质最佳重折叠条件
5. 摸索提高蛋白质聚集温度的条件，以增加蛋白质的稳定性

应用示例1：测试配体与蛋白质结构稳定性的关系。

 

图8：碳酸酐酶 I（1 μM）与 0 至 62.5 mM 的 TFMSA（三氟甲烷磺酰胺）在 25 mM MES、50 mM NaCl、pH 6.1 溶液中孵育。检测结果证明，配体结合会增加蛋白质的热稳定性，其增加量与配体的浓度成正比。

应用示例2：在不同缓冲液中的蛋白质稳定性测定。

 

图9：在 150 mM NaCl 存在下，将 β-乳球蛋白稀释到不同pH 值的 50 mM 缓冲液中，并使用 PROTEOSTAT® 染料测定其聚集温度。

产品特点
1. 实验操作简便、均相，无需进行样品分离或稀释
2. 可快速优化提高蛋白质稳定性的条件 
3. 即使不了解蛋白质的功能或配体结合位点，也能检测配体结合情况 
4. 可在较宽的温度、pH 值和离子强度范围内工作，与常用的缓冲液和辅料均兼容 
5. 为仪器密集型技术的交叉验证提供了一种方便、互补的正交方法

 

试剂盒包含
PROTEOSTAT® TS Detection Reagent
β-Lactoglobulin control
10X Assay Buffer

 

五、蛋白聚集小体检测试剂盒（PROTEOSTAT® Aggresome detection kit）——定量检测与神经退行性疾病、肝病和毒理学研究相关的蛋白聚集小体

 

聚集小体是泛素-蛋白酶体机制被错误折叠和聚集的蛋白质压垮时形成的包涵体。通常情况下，聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。细胞通过隔离折叠错误的蛋白质对自我进行保护，最终通过自噬作用将其清除。

 

聚集小体是阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症或酒精性肝病等多种疾病的标志。过度磷酸化的 tau 蛋白聚集形成神经纤维缠结，β-淀粉样蛋白聚集形成淀粉样蛋白斑块，它们都与阿尔茨海默症有关。路易体（Lewy）主要由聚集的泛素和α-突触核蛋白组成，常见于帕金森病患者的神经元中。马洛里小体（Mallory）与酒精性肝病患者的肝细胞有关。在亨廷顿病中，亨廷顿基因突变会导致变异HTT蛋白的表达，这种蛋白容易聚集并干扰神经元的功能。在真实的细胞环境中检测聚集小体有助于更好地了解与聚集小体相关的疾病。检测聚集小体可用于筛选抑制聚集小体形成的化合物，可能在药物开发方面发挥重要作用。

 

目前检测细胞中蛋白聚集小体主要使用透射电子显微镜以及聚丙烯酰胺凝胶电泳，并结合 WB实验。但是，这两种方法不仅耗时，而且生成的数据难以解读，都不适合高通量研究。荧光显微镜可用于标记蛋白质，在将其转染到培养细胞后可对其聚集情况进行研究。但是，这种方法取决于可检测到的标记蛋白质的数量，这可能会限制研究，甚至还可能影响蛋白质的聚集动力学。例如，GFP 蛋白（238 个氨基酸）比 β 淀粉样肽（39-43 个氨基酸）大得多，可能会阻碍凝集小体的形成。

 

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit（货号ENZ-51035-0025）提供了一种快速、特异和定量的方法，包含独有的488 nm可激发红色荧光分子转子染料，与错误折叠的蛋白或蛋白聚集体结合后可发出强烈荧光。

品名	货号	规格
PROTEOSTAT® Aggresome detection kit	ENZ-51035-0025	25 flow cytometry assays or 50 microscopy assays
	ENZ-51035-K100	100 flow cytometry assays or 200 microscopy assays

 

应用示例1：利用PROTEOSTAT 验证SMER28 抑制神经母细胞瘤细胞系中β-淀粉样蛋白的异噬性积累

 

图10：用beta amyloid 1-42 处理 SK-N-SH 细胞可诱导包涵体形成，荧光显微镜显示，SMER28 能阻止这种积累。(A）未处理的细胞（B）25 μM beta amyloid (C) 25 μM beta amyloid与 5 μM SMER28 (D) 25 μM beta amyloid与 50 μM SMER28

产品特点：

1. 提供高灵敏度、基于细胞的检测，可在真实细胞环境中筛选神经退行性疾病相关的药物
2. 不需要非生理性的蛋白质突变或基因工程改造的细胞系，实验操作简便
3. 已在多种条件下进行了验证，适用于筛选具有潜在治疗价值的化合物
4. 检测流程经过优化，可用于多重荧光免疫组化
5. 可通过流式细胞仪、荧光显微镜等对聚集小体进行定量分析

 

试剂盒包含
PROTEOSTAT®Aggresome detection reagent 
Hoechst 33342 Nuclear stain
Proteasome Inhibitor (MG-132)
10X Assay Buffer

 

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货号	产品名称	规格	应用
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