CoIP实验常见问题

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用，通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体，进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白，同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子。
 

CoIP原理图

CoIP实验对照的设置方法
常见的主要有三种方式，第一种是实验组转染诱饵蛋白和标签蛋白，对照组只转染标签蛋白，这种方法不仅可以提高诱饵蛋白的表达量，增加实验的成功率，而且标签抗体的成本低，亲和力强，但是毕竟不是本身生理状态下的表达量，和实际结果可能有出入，而且需要构建载体，更适用于诱饵蛋白表达量低或者没有IP抗体的情况；第二种是选择IP抗体的对照IgG抗体，这种方式下，诱饵蛋白的表达处于天然状态，更接近真实情况，但是相应的可能出现表达量低，成功率不高的情况，同时需要IP级别的抗体；第三种就是用敲除诱饵蛋白的细胞作对照样本，这种情况下，实验组也是在天然条件下，可信度高，但是实验所需的周期较高，要进行敲除验证。

CoIP试剂盒中样本裂解液可以用WB的裂解液替代吗？
不可以，CoIP的裂解液中一般不含SDS,SDS是一种强效的去垢剂，它能够破坏蛋白质之间的非共价相互作用，使蛋白质变性，这会导致原本相互作用的蛋白质复合体解离。

COIP样本裂解后蛋白浓度一般能达到多少？
不低于1mg/ml,如果蛋白浓度过高，可用pbs稀释。

琼脂糖珠中Protein A和Protein G 有何区别，都要加吗？
一般建议都加，Protein A与兔源抗体亲和力高，Protein G与鼠源抗体亲和力高。

抗体、样本、磁珠的加入顺序比较？
第一种抗体先于蛋白结合，再加入磁珠，第二种抗体先与磁珠孵育，最后加入蛋白，第三种同时加入，一般情况下第一种与第二种相差不大，如果蛋白量过高，比如大于1000ug，建议使用第二种，否则蛋白容易吸附在磁珠上，降低得率。

Input组要跑内参吗？
当然，Input组跑内参不仅可以协助判断操作，对样本是否降解也有提示作用

IP/CoIP结果判读及常见问题
1、CoIP结果如何判读？
 

IB：即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。
IP：即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input：全细胞裂解液，含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体
IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG（abs20035）

结果图解析：
该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。本实验一共分为两大组：Input组及IP组，其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。由Input组的条带可以得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。

2、input组无条带，IP组有条带
 

可能由于目标蛋白在样本中的丰度较低或存在降解现象，这导致在Input组中未能成功检测到该蛋白，而在IP组经过富集后能够检测到。建议适当提高Input组的上样量，进行常规的WB验证，并在样本处理阶段添加蛋白酶抑制剂以稳定蛋白质。

3、杂带问题
非特异性条带要分情况分析，如果是input和IP组、IgG组都有杂带，可能是磁珠的非特异性结合，样本上样量过高、或者抗体浓度过高造成的非特异性结合，建议实验前对磁珠进行漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。如果IgG组和IP组无杂带，
Input有杂带，可能由于WB抗体的特异性不够好，实际实验中可能考虑的因素可能要更多。
 

4、IP和IgG组均无条带
可能由于IP抗体加入的量少，ip抗体特异性差，或者蛋白量过高，优先覆盖住beads，导致IP抗体和Beads的集合较少等，可以优先通过增加抗体用量和优化结合顺序入手，实在没有改善只能更换抗体进行尝试。
 

5、轻重链问题
 

在变性洗脱过程中，抗体在高温和还原剂的影响下分解为重链55KD和轻链分子25KD，当WB所用的抗体和IP抗体同源时，二抗就会识别到IP抗体的轻重链，这是比较常见的一个问题，在抗体选择时，尽量IP抗体和WB抗体来自不同种属，当然，即便已经做了这种优化，实验结果往往还是有轻重链，可能是由于二抗的特异性不够等原因，这种情况下可以采用IP专用的二抗，这种抗体只识别轻链或者重链，如果目的蛋白在轻链附近，选择只识别重链的抗体，或者对于WB实验，建议使用直标一抗，但需注意直标一抗可能因无二抗信号放大作用，而导致信号较弱或无法曝光的情况。
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