重组蛋白/细胞因子的精准选择和正确使用，你值得拥有！

重组蛋白（Recombinant protein）是在实验室中经过重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质，包含细胞因子、多肽类激素以及重组酶制品等多种类型，被广泛应用于蛋白结构和功能研究、细胞培养等研究领域。目前常用的重组蛋白主要为细胞因子类。与从天然来源分离的蛋白相比，重组蛋白的批次间一致性高且供应充足但产品种类众多。既然重组蛋白如此“迷人眼”，怎样才能精准选择适合自己实验的重组蛋白并且正确使用呢？别着急，小优已经总结好了这份指南~

精准选择重组蛋白的九大技巧
首先，我们需要了解重组蛋白的产品特性（表达体系-标签及位置-有无载体蛋白-是否无动物成分-内毒素水平-活性-纯度-片段形式），最后再根据我们的实验目的，精准选择符合要求的重组蛋白产品。

01表达体系
重组蛋白的制备流程可分为：密码子优化-基因合成-表达载体构建-菌株/细胞筛选-蛋白表达-蛋白纯化-蛋白检测。
常用的表达体系有原核、真核表达体系，原核表达体系常用的是大肠杆菌（E.coli），真核表达体系有哺乳动物细胞（HEK293，CHO）、酵母细胞（Pichia）、昆虫细胞（Sf9，sf21，High Five），不同的表达体系各有优劣。

重组蛋白表达体系	优点	缺点
原核	繁殖快，成本低，产量高	不能进行糖基化，蛋白内毒素比其他体系高
哺乳动物细胞	结构与天然蛋白最接近，有完善的翻译后修饰	表达水平较低，周期长，技术要求高
酵母细胞	易操作，蛋白背景弱，适合大规模生产，便于纯化	产量不高，糖基化水平相对高
昆虫细胞	功能与天然蛋白相似，对部分有毒性或难表达的蛋白有优势	糖基化程度低，形式比较单一，活性不如哺乳动物细胞表达体系

表1：重组蛋白表达体系对比[1]

以TNF-α为例，优宁维可提供来自多种表达体系的重组蛋白： 

产品名称	货号	表达体系
Recombinant Human TNF-α Protein	abs05092	CHO
TNF-α Protein, Human	UA040018	E.coli

 

02标签及位置
蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。常用的蛋白标签有His/6xHis、Flag、GST、C-Myc、HA、GFP、mCherry、C-Fc。

标签类型	特点
His/6xHis	标签的分子量小，一般不影响目标蛋白的功能，免疫原性相对较低，不需要切除
Flag	可提高重组蛋白的表达效率或用于WB/IP等下游重组蛋白的检测
GST	增加重组蛋白的可溶性或用于WB/IP等下游重组蛋白的检测，不过分子量较大，可能影响目的蛋白功能和下游实验，标签需进行切除
C-Myc	用于WB/IP等下游重组蛋白的检测，一般不用于蛋白纯化
HA	用于WB/IP等下游重组蛋白的检测
GFP、mCherry	蛋白定位、活细胞成像
C-Fc	Fc是IgG抗体Fc片段，可用于生产具有活性的二聚体蛋白，提高重组蛋白的亲和力[2]

 

以IL10RB为例，优宁维可提供多种标签重组蛋白： 

产品名称	货号
Recombinant Human IL-10RB Protein(C-6His)	abs04075
IL10RB Fc Chimera Protein, Human	UA010621

表2：重组蛋白各种标签对比

关于标签的位置，蛋白标签处于N端或C端的会对重组蛋白的结构与特性造成一定的影响。例如，对于较难表达或较容易降解的蛋白，可将融合标签选择在N端，可以提高重组蛋白的稳定性，也可减小对重组蛋白的免疫原性。但是重组蛋白为分泌蛋白，在其分泌到高尔基体的过程中，处于N端的融合标签会随着N端信号肽的切除而切除，从而失去作用，建议构建在C端。当然，在目的蛋白结构未知的情况下，可以分别于两端加上蛋白标签并进行表达，以确定哪个更有效。

03有无载体蛋白
载体蛋白（Carrier protein）可用于提高重组蛋白的稳定性。塑料管壁对蛋白有很强的吸附作用，会导致重组蛋白粘附在管壁不易分离，进而导致溶液中的试剂浓度偏低，最终表现为活性下降。市面上的重组蛋白产品，会以有载体和无载体两种形式提供，无载体的重组蛋白产品您也可以根据自己的需求，在复溶重组蛋白时或需长期保存时，加入载体蛋白可以预先封闭塑料管壁上蛋白结合位点，避免重组蛋白粘附于管壁，从而保护蛋白活性。常用的载体蛋白有0.1%BSA、5%人血清白蛋白HSA、10%FBS、海藻糖，最常用的是0.1%BSA。

以TNF-α为例，优宁维可提供有载体或无载体蛋白： 

产品名称	货号	有无载体
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	510-RT-010	有载体
TNF-α Protein, Rat	UA040217	无载体

 

04是否无动物成分
无动物成分 (Animal-free) 重组蛋白，即重组蛋白生产过程中不使用任何动物来源的原料和试剂，产品接触的所有材料均不含任何动物成分。在无动物成分条件下生产的与使用标准实验室技术生产的蛋白具有相同的生物活性，同时避免痕量的动物成分、动物病原体和抗原对实验造成影响。无动物成分重组蛋白主要应用于①临床前工作，有可能进入临床试验的重组蛋白药物研究；②需要明确培养条件，尤其是关注微量动物成分或哺乳动物病原体的存在而引起变量的实验。

优宁维可提供无动物成分 (Animal-free) 重组蛋白： 

产品名称	货号
EGF Protein, Porcine (Animal Free)	UA040313-AF
Recombinant Human BMP-4 Animal-Free Protein	AFL314E

 

05内毒素水平
内毒素（Endotoxin）主要是G-菌细胞壁外表层结构成分，本质是脂多糖LPS。内毒素污染十分危险，可引发动物内毒素休克、炎症或败血症，并对组织培养物有害。内毒素的检测方法比较多，主流的两种方法是LAL鲎试剂法，重组C因子法。相较于其他表达系统，大肠杆菌表达系统生产的蛋白具有更高水平的内毒素。在选择重组蛋白产品时，内毒素水平也是参考的一大要素。特别是重组蛋白应用于细胞培养、动物体内实验等领域时，内毒素水平会间接影响实验结果。

优宁维可提供低内毒素重组蛋白： 

产品名称	货号	内毒素水平
Recombinant Cynomolgus B7-H4 Protein(His Tag)	abs06080	<0.1EU/μg
Wnt-3a Protein, Human	UA040120	<0.1EU/μg
Recombinant Human CD44 Fc Chimera Protein, CF	3660-CD-050	<0.1EU/μg

 

06活性
重组蛋白活性分为两个数据：EC50和比活力
1）ED50
半数有效量ED50（Effective Dose 50）是能引起50%阳性反应（质反应）或50%最大效应（量反应）的浓度或剂量，分别用半数有效浓度（EC50）及半数有效剂量（ED50）表示。在比较不同厂家同一重组蛋白产品的ED50时，需比较其在同一种细胞上测得的ED50值，一般来说ED50值越小，作用越强。
2）比活力 (Specific Activity)
在特定条件下，单位重量 (mg) 蛋白质所具有的酶活力单位数。对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。

优宁维可提供高活性重组蛋白： 

产品名称	货号
Recombinant Mouse TGF-β1 Protein	abs04222
RSPO1 Protein, Mouse	UA040213
Recombinant Mouse IL-33 Protein	3626-ML-010

07纯度
重组蛋白的纯度可通过SDS-PAGE或HPLC鉴定。在选择重组蛋白产品时，纯度也是参考的一大要素。

优宁维可提供高纯度重组蛋白： 

产品名称	货号	纯度
Recombinant Human IL-2 Protein	abs06485	＞95%
GM-CSF Protein, Human	UA040002	＞95%
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	510-RT-010	＞97%

08片段形式
由于技术限制、表达效率等方面的问题，重组蛋白使用片段形式可能更易于纯化和表达，提高溶解性和稳定性。
优宁维可提供片段形式重组蛋白： 

产品名称	货号
TNF-α(80-235aa), Mouse	UA040059
Recombinant Human FGF-basic (154aa) Protein	abs05144
Recombinant Human Klotho (aa 34-981) Protein, CF	5334-KL-025

09实验目的
了解了重组蛋白的特性之后，我们就可以根据自己的实验目的选择合适的重组蛋白产品了。常见的有：蛋白结构研究-动物体内实验-蛋白相互作用研究-蛋白定位（活细胞成像）-细胞培养-用作抗原生产高质量抗体-抗体分析中作为阳性对照（如ELISA标准品）。（ps：实验目的是按对重组蛋白整体品质（如表达体系、内毒素、活性）要求的高低排序呦）。

不同的实验目的对于重组蛋白的表达体系、纯度等要求有所区别。例如：
1.蛋白结构分析需尽量保存天然序列且具有天然活性，因此首选真核表达体系[1]，同时蛋白纯度需＞95%，高活性，一般不使用片段形式；
2.动物体内实验时，BSA可能会影响小鼠的免疫情况，可优先选择无载体重组蛋白或选择5%海藻糖作为载体蛋白；优先选择无动物成分重组蛋白；另外，内毒素水平要求＜0.1EU/μg，纯度＞95%，高活性（具有活性的片段形式也可用）；
3.蛋白相互作用研究要求重组蛋白带有标签，同时蛋白纯度需＞90%，高活性；
4.做蛋白定位和活细胞成像需要使用带有荧光标签的蛋白，含BSA重组蛋白在SDS-PAGE中的迁移或者掩盖活细胞成像中的可视化信号，此时，可优先选择无载体重组蛋白；内毒素水平＜1EU/μg，纯度＞90%，高活性（具有活性的片段形式也可用）；
5.细胞培养要求重组蛋白内毒素水平＜1EU/μg，纯度＞90%，高活性（具有活性的片段形式也可用）；一般情况下，载体蛋白对于细胞培养没有影响，除非无血清培养时需避免使用含有BSA/HAS/FBS的重组蛋白，可用5%海藻糖替代；
6.用作抗原生产高质量抗体要求重组蛋白纯度＞80%，高活性（具有活性的片段形式也可用）；
7.抗体分析中作为阳性对照（如ELISA标准品）要求使用有载体重组蛋白，纯度＞80%。

技巧如此多，记不住？So easy！小优已经总结好了~
 

图1：重组蛋白选择技巧汇总

正确使用重组蛋白
重组蛋白的使用也是一门学问，接下来就让小优从溶解-保存两方面来告诉大家吧！
01溶解
目前细胞因子多数以冻干粉形式提供，溶解前一定要将冻干粉离心收集于离心管底部（10,000-12,000 rpm离心 30 s），不同的冻干蛋白需要的溶解剂不同，推荐溶解的浓度也会有所不同（一定要溶解到说明书推荐的浓度范围，否则可能会造成不完全溶解或活性减弱），使用前应当详细阅读说明书。同时，溶解重组蛋白时，用枪头轻轻吹打混匀，切记不可涡旋（涡旋过程中产生的剪切力可能会导致蛋白质结构的改变）。

举个例子

产品名称	货号	推荐溶剂	推荐浓度范围
Human IGF-I Protein	abs04177	500mM乙酸	＞100 μg/ml
IL-2 Protein, Mouse	UA040171	无菌水	0.1-1mg/mL
Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein	410-MT-025	0.1%HSA/BSA的无菌PBS	100 μg/mL

 

02保存
重组蛋白冻干粉可保存于＜-20℃至产品有效期，室温一般储存三周左右；
重组蛋白溶液一般可在2-8°C下储存一周左右。可将溶液分装于聚丙烯管中（不会吸附蛋白）避免反复冻融，于在<-20°C下稳定保存3个月左右（具体保存方法及时长详见说明书）；

1.    Schütz, A., et al., A concise guide to choosing suitable gene expression systems for recombinant protein production. STAR Protocols, 2023. 4(4).
2.    孙钰芳,宗辉,郭诗雨,陈思敏,安毛毛,慎慧. 重组Fc融合蛋白类药物研究进展[J]. 中国临床医学, 2022, 29(1): 97-104.