MTT 实验详细指南：开启细胞实验之门的关键钥匙

1.细胞准备阶段

首先，要将细胞培养至对数生长期。这个时期的细胞生长状态最为活跃，其生理特性稳定，对于后续实验结果的准确性至关重要。接着，使用胰蛋白酶对细胞进行消化处理，然后进行计数。之后，把细胞浓度调整到合适的范围，这个范围一般是每毫升几千到几万个细胞。比如，对于某些生长速度适中的细胞，可能调整到每毫升 5000 - 8000 个细胞；而对于生长较快或较慢的细胞，则需要根据其特性来确定具体浓度。 

 

 

2.接种细胞环节

 

取适量已经准备好的细胞悬液，将其接种到 96 孔板之中。每孔的体积通常在 100 - 200 微升这个区间内。至于每孔的细胞数量，会依据实验设计而有所不同，大致在 1000 - 10000 个。这里要考虑到细胞类型的差异以及实验目的的不同，比如研究某种药物对快速增殖细胞的影响时，可能每孔接种 5000 - 8000 个细胞；若研究对生长缓慢细胞的作用，则可能每孔接种 2000 - 3000 个细胞。  

               

 

 

3.孵育处理步骤

 

根据具体的实验设计，可能需要向 96 孔板的孔中添加不同种类的处理剂，这些处理剂包括药物、生长因子或者对照溶液等。添加完成后，把 96 孔板放置在二氧化碳培养箱中进行孵育。孵育时间根据实验要求而定，一般是从 24 小时到数天不等。在这个过程中，细胞会对所添加的处理剂产生相应的反应，为后续的检测提供条件。

 

 

4.加入 MTT 溶液操作

 

当孵育阶段结束后，向每个孔中添加一定量的 MTT 溶液，其常用浓度为每毫升 5 毫克。添加完成后，继续孵育几个小时，一般是 2 - 4 小时。在这个过程中，活细胞中的相关酶会发挥作用，将 MTT 还原为甲瓒。

 

 

5.终止反应与溶解甲瓒过程

 

把 96 孔板中的培养基移除，然后向每孔中加入二甲基亚砜（DMSO），其目的是溶解在之前步骤中形成的甲瓒结晶。加入 DMSO 后，要轻轻振荡 96 孔板，以此确保甲瓒能够充分溶解，为后续准确测量吸光度值做好准备。

 

6.读取吸光度步骤

 

使用酶标仪在 490 纳米或者 570 纳米的波长处对各个孔的吸光度值进行测量。这里要注意设置空白对照孔，空白对照孔是不含细胞但经过和其他孔相同处理的孔，它的作用是校正背景吸光度，从而提高测量结果的准确性。

 

7.数据分析阶段

 

根据标准曲线或者参照对照组的数据，计算出细胞的相对存活率或者增殖指数。吸光度值（OD 值）越高，就意味着细胞的活性越强或者细胞数量越多，这为评估细胞在不同处理条件下的状态提供了量化依据。

 

~~实验注意事项~~

 

细胞状态	用于实验的细胞必须处于良好状态，应避免使用有污染或老化的细胞。
细胞密度	细胞接种密度要合适，不同类型的细胞有不同的适宜密度范围。
MTT 试剂	MTT 试剂要妥善保存，通常需要在低温（一般 -20℃）、避光条件下保存，以防止其分解失效。
DMSO（二甲基亚砜）	DMSO 用于溶解甲瓒结晶，其纯度要高，杂质可能会干扰吸光度的测量。
胰蛋白酶消化	在细胞准备阶段，使用胰蛋白酶消化细胞时，要控制好消化时间和温度。
孵育条件	孵育过程中，CO₂培养箱的温度、CO₂浓度和湿度要保持稳定。
吸光度测量	使用酶标仪测量吸光度时，要提前预热酶标仪，使其达到稳定的工作状态。