THUNDER与JAK/STAT 竟如此默契？

自1992年JAK/STAT信号通路被首次揭示以来，至今已过去30余年。迄今与此通路有关的科学论文超过10万余篇，近年来，随着对JAK/STAT信号通路研究的深入，针对该通路的药物研发取得了显著进展，特别是在血液系统疾病、肿瘤、类风湿性关节炎和银屑病等治疗领域。

一、JAK/STAT通路调控机制

JAK/STAT信号通路的发现源于对细胞如何响应干扰素（IFN）的研究。该通路涉及Janus激酶（JAK）家族成员JAK1、JAK2、TYK2和JAK3，以及信号转导及转录激活因子（STAT）。

JAK-STAT信号通路的典型激活：细胞因子与相应的受体结合，它们发生构象变化并招募相关的JAK。JAK经历磷酸化，这导致受体的酪氨酸磷酸化，从而为STATs创建对接位点。STATs被磷酸化，与受体分离，并以同型二聚体或异型二聚体的形式进入细胞核，结合特定的DNA位点，调节细胞因子相关的基因转录。

JAK-STAT信号通路的负调控：CIS/SOCS（细胞因子信号抑制剂）、PIAS（激活STAT的蛋白抑制剂）和PTP（蛋白酪氨酸磷酸酶）家族参与了JAK-STAT信号通路的负调控。

图1：JAK-STAT信号通路的典型激活（实线）和负调控(虚线）

二、JAK/STAT通路的应用及药研进展

JAK/STAT信号通路在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，如免疫调节、肿瘤发生发展、炎症、自身免疫疾病等，JAK-STAT通路中的基因突变和基因多态性广泛参与了人类疾病的发病机制。由于JAK/STAT信号通路在多种疾病中的关键作用，针对该通路的药物开发已成为研究的热点。目前已有多个JAK抑制剂已被临床批准用于各种疾病的治疗，越来越多的创新候选药物正在临床前和临床试验中。

图2：人类疾病中JAK-STAT通路的突变

图3：JAK抑制剂应用简报

三、THUNDER JAK/STAT相关检测

1、THUNDER TR-FRET检测原理

通过测量体外JAK抑制剂对信号转导及激活因子（STAT）磷酸化（pSTAT）的影响来评估其效果。时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是一种基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技术，采用夹心法，检测胞内磷酸化蛋白。

图4：THUNDER检测原理示意图

2、完全验证数据

①磷酸化蛋白-稳健性（ROBUSTNESS）

THUNDER Phospho-STAT3检测使用HELA细胞（100,000个细胞/孔）在无IFNα-2b和10nM IFNα-2b室温孵育60分钟。Z值为0.94，表明该检测稳定可靠，适合HTS。
THUNDER Phospho-STAT6检测使用HELA细胞（100,000个细胞/孔）在无IL-4和有1 nM IL-4的情况下室温孵育20分钟。这Z值为0.86，表明该检测稳定可靠，适合HTS。

图5：（左）Phospho-STAT3, Z’-factor value of 0.94.（右）Phospho-STAT6, Z’-factor value of 0.86 .

②磷酸化蛋白—稳健性（ROBUSTNESS）

THUNDER Phospho-STAT6 使用HELA细胞（100,000个细胞/孔，三复孔）与IL4室温孵育30分钟。数据显示IL-4可明显刺激HELA细胞STAT6 Y641位点的磷酸化。
THUNDER Phospho-STAT6将使用THP-1细胞（200,000个细胞/孔，三复孔）与IL-4室温孵育20分钟。数据显示，IL-4可明显刺激THP-1细胞STAT6 Y641位点的磷酸化。

图6：STIMULATION OF PHOSPHO-STAT6 (Y641) IN HELA and THP-1 CELLS

③磷酸化蛋白—CONTROL LYSATE TITRATION

磷酸化水平实验时，阳性细胞裂解物的titration检测是必要的质量控制（QC）测试，是确保实验结果准确性和可重复性的关键步骤。

THUNDER Phospho-STAT5 （Y694/Y699）检测试剂盒常规针对EGF处理的A431裂解物进行了测试。将A431细胞在T175培养瓶达到100%，用300nM EGF室温刺激10分钟。使用4 mL 1X 裂解缓冲液2进行细胞裂解后，裂解物用1X裂解缓冲液2连续稀释，三复孔检测。数据显示：裂解物稀释度与TR-FRET比率值之间的线性关系。

图7： PHOSPHO-STAT5 A431 CONTROL LYSATE TITRATION

*THUNDER所有磷酸化蛋白检测试剂盒均做完全验证。

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*磷酸化检测试剂提供以下规格：100 points，500 points，2500 points，5000 points，10000 points。

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参考文献：
①Nordmann, T.M., Anderton, H., Hasegawa, A. et al. Spatial proteomics identifies JAKi as treatment for a lethal skin disease. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08061-0
②Xue, C., Yao, Q., Gu, X. et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway: autoimmune disorders and cancer. Sig Transduct Target Ther 8, 204 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01468-7