深度剖析表面等离子共振技术（SPR）

01~技术简介

SPR

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术是一种新型检测分析技术，它以光学原理为基础且无需标记。这种技术能够实时检测两个或者更多分子之间的结合情况。SPR 仪器平台具备通量高、灵活性强以及灵敏度高的特点，这些优势使得研究者在结合研究中可以对生物分子相互作用进行表征，而且该技术广泛适用于不同类型的分子，像离子、分子片段、小分子、蛋白质、病毒等都在其适用范围内。SPR 技术还能够为研究者提供诸如亲和力、动力学、热力学等生物物理数据。

02~SPR基本原理

SPR 是一种生物传感分析技术，它借助传统光学现象，当光在不同介质中产生消逝波后，该消逝波会与等离子波产生共振，凭借这一原理，SPR 能够构建起对生物分子相互作用进行分析的体系，可用于检测生物传感芯片上配位体和分析物之间相互作用的情况。

SPR 生物传感器以偏振光作为光源，其传感芯片的表面镀有一层金膜。在开展实验时，首先要把一种生物分子（也就是靶分子）固定于金膜表面，接着将和靶分子存在相互作用的其他分子溶入溶液（或者混合液），再让该溶液（或混合液）流过芯片表面。

当处于金膜芯片上的蛋白和处于流路中的分子发生结合与解离这一系列过程时，共振角（即 SPR 角）便会相应地出现变化。此时，检测器会对这种变化进行检测，然后依据这种变化曲线来作图分析，通过这种方式，就可以得出分子间的结合常数 Ka、解离常数 Kd 或者亲和力常数 KD。

SPR 生物传感器的光源是偏振光，在其传感芯片表面有一层金膜。实验操作时，先将某一种生物分子（靶分子）固定在金膜表面，随后把与靶分子相互作用的分子放在溶液（或混合液）中，使该溶液（或混合液）流经芯片表面。在这个过程中，金膜芯片上的蛋白和流路中的分子会有结合与解离的情况，而这会使共振角（SPR 角）产生变化。这种变化会被检测器捕捉到，通过对变化曲线的分析作图，就能得到分子间的结合常数 Ka、解离常数 Kd 以及亲和力常数 KD。

SPR 生物传感器采用偏振光作为光源，其传感芯片的表面覆有金膜。在实验过程中，首先是把一种生物分子（靶分子）固定于金膜之上，之后将与该靶分子有相互作用的分子溶入溶液（或混合液），并使该溶液（或混合液）流过芯片表面。当金膜芯片上的蛋白和流经的溶液（或混合液）中的分子在结合、解离过程中，共振角（SPR 角）会随之改变。检测器会检测到这种改变，依据变化曲线进行作图分析，进而得出分子间的结合常数 Ka、解离常数 Kd 和亲和力常数 KD。

03~专业术语介绍

1. 配体 (Ligand)

芯片表面所固定的生物分子即为配体。配体有两种固定于芯片表面的方式，一种是借助化学偶联试剂，通过共价键的形式将其固定；另一种则是运用捕获的方法，利用其与高亲和力结合的特性，将其固定在一个已经偶联在芯片表面的捕获分子上。

2. 分析物 (Analyte)

分析物是一种以溶液形式流经配体的、与配体存在相互作用的分子。

3. 再生 (Regeneration)

再生是在完成一个分析循环之后，将芯片表面剩余的分析物清除的过程。在此过程中，需要确保配体不被破坏，从而为下一个分析循环创造良好条件。

4. 传感图

以结合响应值为纵坐标、时间为横坐标作图，所得到的图就是传感图。结合响应值的单位是共振单位 (RU) ，而且该响应值与芯片表面生物分子的浓度呈正比关系。

04~SPR中Ligand的选择标准

1. 生物分子稳定性

生物分子的偶联活性稳定对于实验有着重要意义，这有利于保障实验的重复性，同时也能延长芯片的使用寿命，使芯片能在多次实验中稳定发挥作用。

2. 生物分子的纯度

在生物分子纯度方面，共价偶联（covalent）方式对纯度要求较高，因为这种方式对生物分子的性质要求更严格；而捕获（capture）方式对纯度要求相对低一些，不过也需要满足一定的纯度标准以保证实验的正常进行。

3. 化合价

对于结合实验而言，其结果与生物分子的化合价并无关联；然而在动力学实验中，把多价的分子当作配体（ligand）更为合适，比如在抗原抗体实验中就推荐固定抗体来更好地开展实验。

4. 通量

在通量方面，氨基偶联和生物素固定的方式存在一定限制，即不能更换配体（ligand），而其他捕获法在这方面则具有优势，可以对配体进行更换，从而在实验设计上有更多的灵活性。

5. 与芯片的非特异结合

若生物分子与芯片存在非特异结合的情况，那么这种生物分子不能充当分析物（Analyte），否则会对实验结果产生干扰，影响分析的准确性。

05~SPR实验中的注意事项

1. 关于分析物与空白通道的非特异结合问题

要关注分析物 (Analyte) 是否会与空白通道产生非特异结合现象，因为这种非特异结合可能会干扰实验结果，使数据出现偏差，影响对分析物真实性质和反应情况的判断。

2. 消除信号干扰的方法

通过设置对照表面来减少或消除容积差等因素所导致的信号干扰。对照表面的设置能够为实验提供一个参照标准，有助于更准确地识别和分离出真正由目标生物分子相互作用所产生的信号。

3. 流速相关要点

流速在不同类型的实验中有不同的要求。在结合测试中，流速应大于 20μl/min；而在亲和力实验中，流速为 30μl/min。合适的流速对于保证实验的准确性和有效性至关重要，它会影响分析物与配体之间的相互作用效果以及信号的检测。

4. 浓度因素

浓度与亲和力密切相关。一般情况下，可以尝试在 0.1 - 10 KD 的浓度范围内进行实验，或者从出现结合信号时开始逐渐提高浓度，直至结合曲线呈现出饱和趋势。这样可以全面了解分析物与配体在不同浓度下的结合情况，从而更好地分析亲和力相关数据。

5. 结合和解离时间的设定

要设置合适的结合和解离时间。合适的时间设定能够确保分析物与配体有足够的时间充分相互作用，同时也能准确捕捉到它们的解离过程，这对于准确获取实验数据、分析生物分子间的动态相互作用具有关键意义。

6. 样品特性要求

要确保样品具有均一性，而且溶解性要好，同时还要注意样品是否容易发生聚合。只有满足这些条件的样品，才能在实验中表现出稳定、可预测的行为，避免因样品自身问题而导致实验结果的误差和不确定性。

06~SPR测量系统

1.光学系统

在光学系统中，那些能够产生并测量 SPR 信号的光电组分被称作光学检测单元。这个单元对于整个 SPR 测量系统而言至关重要，它是获取和分析 SPR 信号的关键所在，为后续对生物分子相互作用的研究提供了基础数据支持。

2.传感器芯片

传感器芯片是 SPR 传感器的核心部件。在 SPR 技术的应用中，首要步骤是将一个生物分子偶联在传感片上，随后利用这个已偶联生物分子的传感片去捕获能够与其发生特异反应的其他生物分子。传感器芯片主要由三个部分构成，分别是光波导耦合器件、金属膜以及分子敏感膜。光波导耦合器件负责引导光信号的传输，确保光信号能在芯片内准确传播；金属膜在 SPR 现象的产生中扮演关键角色，它与光和生物分子相互作用密切相关；分子敏感膜则是生物分子结合的重要区域，对检测生物分子间的相互作用具有敏感性。

3.液体处理系统

液体处理系统包括两个液体传送泵。其中一个泵的主要职责是维持稳定流速的液体流过传感芯片表面，这对于保证实验过程中液体环境的稳定性、确保生物分子在稳定的条件下相互作用至关重要。另一个泵则负责自动进样装置中的样品传送，保证样品能够准确、有序地进入到实验体系中，从而实现对不同样品的检测分析。

4.其他部分

除了上述主要部分外，还有其他部分，例如 LED 状态指示器和温度控制系统等。LED 状态指示器可以直观地显示系统的运行状态，方便操作人员及时了解系统情况；温度控制系统则能够对测量系统的温度进行调控，因为温度对于生物分子的活性以及实验的准确性都有着重要影响，合适的温度环境有助于提高实验结果的可靠性。

07~SPR特点

①待分析物无需标记

在这种分析技术中，待分析物不需要进行标记处理。这一特性极大地简化了分析流程，避免了标记过程可能对分析物本身性质造成的影响，同时也减少了因标记不均匀等问题而导致的误差。

②实时动态监测（即定量结合亲和力、动力学和热力学）

能够对分析过程进行实时动态监测，具体包括对定量结合亲和力、动力学和热力学信息的监测。这意味着可以在分析物与相关物质相互作用的过程中，即时获取关键的参数变化情况，深入了解它们之间相互作用的本质和规律。

③高通量能力非常灵敏，结果可重复

该技术具备高通量能力，并且具有很高的灵敏度，其检测结果可重复性强。高通量能力使得在短时间内可以处理大量的样本数据，而高灵敏度则可以检测到细微的变化，可重复性则保证了实验结果的可靠性和科学性。

④测量各种开机率、关断率和亲和力

可以对各种开机率、关断率以及亲和力进行测量。这些参数对于全面评估分析物与其他物质之间的相互作用特性具有重要意义，有助于准确把握它们之间的关系和作用机制。

⑤所需待测样品量小

所需要的待测样品量很少，这一优点在样品获取困难或者样品本身珍贵的情况下尤为突出，大大降低了对样品量的要求，提高了分析的可行性和效率。

⑥响应速度快

具有快速的响应速度，能够迅速对分析物与其他物质之间的相互作用做出反应，从而及时获取相关数据。这在需要快速分析的场景中具有很大优势，能够有效提高分析效率和时效性。

名称	货号	规格
Human SPR Gene Knockout Kit(CRISPR)	abs6105494-1kit	1kit
Recombinant Human SPR His-tag Protein, CF	10209-SP-020	20UG
SPR (A-11): m-IgGκ BP-HRP Bundle	sc-524843	1kit