ACSL4

ACSL4 dictates ferroptosis sensitivity by shaping cellular lipid composition

铁死亡是一种由谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）调控的细胞坏死形式。早期研究揭示了erastin (ERA)通过抑制系统xc-来诱导铁死亡，随后GPX4抑制剂RSL3也被发现。然而，某些细胞类型对铁死亡具有抗性。为了深入理解这种抗性的分子机制，并探索在病理条件下预防铁死亡的可能性，本研究聚焦于酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）。

1、ACSL4是铁死亡过程中的关键促死基因

在本研究中，作者采用了两种方法来确定铁死亡的关键基因。首先，作者创建了抗铁死亡的细胞系，这些细胞在GPX4失活后特异性地抵抗铁死亡，并且在用GPX4抑制剂RSL3处理时不会触发其他细胞死亡途径。通过对这些细胞进行基因表达分析，作者鉴定了ACSL4作为潜在的关键基因。其次，作者还利用全基因组隐性遗传筛选方法，通过慢病毒CRISPR指导的RNA（gRNA）文库，两次筛选了能够调节ERA或RSL3诱导的铁死亡敏感性的基因。结果显示，靶向ACSL4的gRNA在测序结果中占据了显著比例，进一步证实了ACSL4在铁死亡过程中的重要作用。这两种方法均独立地指出了ACSL4在铁死亡中的核心地位，表明其是铁死亡敏感性的关键因素，特别是在某些基底样乳腺癌细胞中，ACSL4的药理抑制具有巨大的治疗潜力。

图1 Acsl4是必需的促铁死亡基因

2、ACSL4对GPX4抑制后的脂质氧化至关重要

为了探究ACSL4缺失如何提供对铁死亡的保护作用，作者深入分析了铁死亡的特征性表现。通过对野生型（WT）和ACSL4敲除（KO）细胞进行电子显微镜观察，作者发现ACSL4 KO细胞对RSL3诱导的线粒体外膜破裂展现出显著增强的抵抗力。为了确认ACSL4在铁死亡中的特异性作用，作者进一步研究了其他ACSL亚型基因缺失对铁死亡敏感性的影响，结果显示这些亚型的缺失并未对铁死亡敏感性产生显著影响。此外，ACSL4 KO细胞还被发现对除RSL3以外的其他铁死亡诱导剂同样具有高度抗性，但对其他形式的细胞死亡诱导剂则无此抗性，这进一步强化了ACSL4与铁死亡诱导之间的特异性联系。这些发现表明，在GPX4被抑制后，ACSL4对于脂质氧化的发生是不可或缺的。

图2Acsl4 WT和KO细胞的电镜分析

鉴于ACSL4具备优先催化长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)参与磷脂生物合成的独特功能，作者推测PUFAs可能是驱动铁死亡过程的关键“燃料”。为了验证这一假设，作者设计了一系列实验：首先，他们对Acsl4敲除（KO）细胞进行了富集处理，并利用RSL3诱导铁死亡，随后补充不同类型的脂肪酸。结果显示，与ω-3脂肪酸相比，ω-6脂肪酸在诱导细胞死亡方面的效率高出5至10倍。

接着，作者对铁死亡过程中可能产生的氧化磷脂进行了深入分析，并发现磷脂酰乙醇胺（PE）中富含花生四烯酸（AA）和肾上腺酸（AdA）的物质更容易成为氧化的首选目标。为了更精确地了解ACSL4在脂质合成中的作用，作者采用质谱技术和定量分析手段，发现Acsl4 KO细胞中AA-和AdA-PE的含量显著低于野生型（WT）细胞，这直接证明了ACSL4在促进AA和AdA的脂质生物合成中的关键作用。

进一步地，作者比较了RSL3处理的Acsl4 WT和KO细胞中脂质氧化的程度，并发现Acsl4的缺失显著抑制了含双氧化和三氧化的AA-和AdA-PE物质的形成。这些数据有力地表明，ACSL4的缺乏导致AA-和AdA-PE物质的含量下降，而这些物质正是GPX4缺失或失活条件下引发铁死亡的必需底物。因此，ACSL4不仅通过调节PUFAs的利用来影响磷脂的生物合成，还间接地决定了细胞在面临铁死亡压力时的命运。

图3 ACSL4通过将AA和AdA特异性酯化成PE调节铁死亡敏感性

3、ACSL4增强基底样乳腺癌细胞对铁死亡的敏感性

有研究表明，特定乳腺癌细胞系对系统xc-所必需的谷氨酰胺代谢有显著依赖，这可能预示着它们与铁死亡之间存在某种关联。进一步地，谷氨酰胺营养缺陷的细胞系对RSL3表现出明显的敏感性。基于这些线索，作者深入分析了这些细胞，并发现ACSL4在一系列基底样乳腺癌细胞系中呈现出优先表达的特点。值得注意的是，ACSL4的表达水平与这些细胞系对RSL3诱导的铁死亡的敏感性之间存在高度相关性。

尤为重要的是，尽管作者对其他已知的铁死亡调节因子进行了详细检查，如细胞内谷胱甘肽（GSH）水平、系统xc-的活性以及GPX4的活性等，但在这些对铁死亡敏感的细胞系中，并未观察到这些因子的显著下调。这一发现进一步强调了ACSL4在基底样乳腺癌细胞铁死亡敏感性中的独特且核心的作用，为针对这类肿瘤的铁死亡疗法提供了新的潜在靶点。

图4 ACSL4在基地样乳腺癌细胞中的表达

作者进一步利用CRISPR–Cas9基因编辑技术，在MDA-MB-157乳腺癌细胞中特异性地消除了ACSL4的表达。随后，通过BODIPY染色进行脂质过氧化分析，结果显示这些ACSL4缺失的细胞对脂质过氧化过程表现出了显著的抗性。为了验证这一发现的特异性，作者又在这些ACSL4敲除的细胞中重新引入了带有Flag标签的ACSL4（即ACSL4-Flag），并发现恢复ACSL4的表达后，细胞重新获得了对RSL3诱导的细胞死亡和脂质过氧化的敏感性。这些实验结果表明，ACSL4在MDA-MB-157乳腺癌细胞的铁死亡过程中扮演着至关重要的角色，其表达水平的变化直接影响着细胞对铁死亡的敏感性。

图5 ACSL4决定一组基地样乳腺癌细胞对铁死亡的敏感性

4、药理抑制ACSL4可有效阻止铁死亡的发生

为了探索ACSL4的药理学抑制作为潜在治疗铁死亡途径的可能性，作者进行了深入研究。基于早期的研究报道，噻唑烷二酮（TZDs）类药物被证实具有选择性抑制ACSL4的功能。在本研究中，作者发现TZDs家族中的罗格列酮（ROSI）、吡格列酮（PIO）以及曲格列酮（TRO）均能有效抑制Pfa1细胞中由RSL3诱导的铁死亡及脂质过氧化过程。这一发现不仅揭示了TZDs类药物在调节ACSL4活性方面的潜力，同时也为开发针对铁死亡相关疾病的新型治疗策略提供了重要线索。

图6

作者进一步发现，罗格列酮（ROSI）对RSL3诱导的铁死亡所提供的保护作用，与在ACSL4敲除（KO）细胞中观察到的现象颇为相似。为了探究ROSI的这种保护作用是否源于其能够模拟ACSL4缺乏时脂质组成的变化，作者深入分析了经ROSI处理的野生型（WT）和ACSL4敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中所有主要的磷脂酰乙醇胺（PE）种类。结果显示，WT细胞在ROSI处理后，其PE的脂质体变化与ACSL4耗竭所引起的变化相一致。尤为重要的是，当对ACSL4敲除的细胞再施以ROSI处理时，含花生四烯酸（AA）和肾上腺酸（AdA）的PE含量并未进一步降低，这有力地证明了ROSI确实能够抑制ACSL4的活性。

图7 

本篇文章深入探讨了ACSL4在调节细胞对铁死亡敏感性方面的关键作用，并明确指出ACSL4依赖性的磷脂（尤其是磷脂酰乙醇胺PE）的调节是决定细胞对铁死亡敏感性的核心因素。文章通过一系列实验，不仅揭示了ACSL4在铁死亡过程中的生物学功能，还发现了药理抑制ACSL4（如通过噻唑烷二酮TZD类药物）可能作为一种有效的药理学干预手段，用于调节和阻止铁死亡的发生。

此外，文章还提出了一个引人深思的观点：TZD类药物在不同组织病理学中展现出的某些细胞保护作用，可能与其抑制ACSL4活性、进而调节磷脂代谢和铁死亡敏感性的能力密切相关。这一发现不仅为理解TZD类药物的作用机制提供了新的视角，也为开发针对铁死亡相关疾病的新型治疗策略提供了潜在的靶点。

综上所述，本篇文章的研究成果不仅加深了我们对ACSL4和铁死亡之间关系的理解，还为未来相关领域的研究和药物开发指明了方向。这种对ACSL4依赖性磷脂调节机制的研究，以及药理抑制ACSL4作为潜在治疗手段的探讨，无疑将为铁死亡相关疾病的治疗带来新的希望和可能。

名称	货号	规格
ACSL4	304506-100ug	100ug
ACSL4	304508-100ul	100ul
ACSL4	385302-200ul	200ul
ACSL4 (F-4)	sc-365230	200ug/ml