Pcr Array

荧光定量PCR（qPCR）技术因其在核酸检测中的广泛应用而闻名，但长久以来受限于较低的通量。厦门大学李庆阁教授领导的团队突破了这一局限，开发了一种创新的qPCR技术——MeltArray，这项技术能够实现单管内检测多达72个靶标，颠覆了qPCR低通量的传统观念。MeltArray技术通过利用Taq DNA聚合酶的5'-内切酶活性，将媒介探针转化为媒介引物，这些媒介引物随后与分子信标报告探针结合，在聚合酶的作用下生成具有特定熔点的荧光双链，实现了对多个靶标的高阶多重检测。这项技术不仅提高了检测效率，还为疾病诊断和生物医学研究提供了更为强大的工具。

李庆阁教授领导的团队所提出的“MeltArray”技术，通过创新性地结合Taq DNA聚合酶的5'-瓣状内切酶活性和分子信标报告探针，实现了在单个荧光通道中检测多达12个靶标，而利用6个荧光通道的设备理论上能够检测72个靶标。这项技术不仅打破了传统qPCR在检测靶标数量上的限制，还成功地将qPCR的检测能力从低通量提升至中通量水平，填补了低阶PCR与高通量测序技术之间的技术空白。MeltArray技术的问世，为核酸检测领域带来了革命性的进步，极大地增强了qPCR的检测能力和应用范围。

背景

荧光定量PCR（qPCR）技术因其高灵敏度和特异性而在核酸检测领域被广泛应用，但其低通量的特性限制了其在临床应用中的潜力。传统的qPCR技术主要依赖于靶标特异性的荧光探针，当需要同时检测多个靶标时，就需要设计和合成多个荧光探针，这不仅增加了成本，也限制了检测的通量。

MeltArray技术由厦门大学李庆阁教授团队开发，这项技术通过使用一种特殊的“媒介探针”，结合Taq DNA聚合酶的5'-瓣状内切酶活性和分子信标报告探针，实现了在单个荧光通道中检测多达12个靶标，而使用6个荧光通道的设备理论上可以检测72个靶标，这一突破性成果极大地提升了qPCR的检测能力。

在MeltArray技术中，媒介探针包含一个与靶标结合的特异性部分和一个通用的barcodes部分，其3'末端被封闭。在PCR过程中，媒介探针与靶标结合后，被Taq聚合酶的5'端核酸酶活性裂解，释放出的媒介引物随后启动通用报告系统。这个通用报告系统由分子信标和与媒介引物结合的区域组成，媒介引物与分子信标中的特定区域互补并引发引物延伸，导致分子信标的水解，从而释放荧光信号。

MeltArray技术的问世，不仅提高了qPCR的检测通量，还降低了成本，简化了操作，为核酸检测领域带来了革命性的进展。

研究结果

分子信标报告系统

在对比线性Taqman探针和分子信标作为报告系统的优劣时，研究发现两种探针都能产生正常的扩增曲线和熔解曲线。然而，线性Taqman探针在熔解曲线分析中出现了两个峰值，包括一个主峰和一个较小的杂峰，这可能是由于线性探针与多余的媒介探针形成荧光杂交，导致背景信号增加。相比之下，分子信标报告系统在熔解曲线中仅显示出一个峰值，背景更为干净，这表明分子信标具有更高的特异性和更低的背景干扰，更适合于多重荧光定量检测。因此，在MeltArray技术中，分子信标因其清晰的背景和高特异性而被选用作为报告系统。

 

作者通过实验验证了分子信标报告系统能够同时捕获多个媒介引物。在实验中，他们设计了针对KRAS和BRAF基因的媒介探针，这些探针的媒介序列能够与分子信标报告系统中的不同区域结合。由于媒介引物延伸产生的产物序列长度不同，它们在熔解曲线分析中展现出不同的Tm值。实验结果显示，KRAS的Tm值为67.5℃，而BRAF的Tm值为79.0℃。这些结果证实了分子信标报告系统能够区分并检测两种媒介探针，从而证明了该系统在多重荧光定量PCR检测中的有效性和可行性。

研究者进一步对四重5'-FEN PCR技术进行了验证，该技术用于检测四个特定的染色体序列标记位点（sY242、ZFX/Y、sY82、sY86）。实验结果成功地检测出了所有四个靶标，并且它们的Tm值呈现出递增的顺序：sY242（49.6℃）< ZFX/Y（55.6℃）< sY82（63.2℃）< sY86（68.4℃）。这一发现证实了四个媒介探针能够共用一个分子信标报告系统，实现四重5'-FEN PCR检测。

因此，研究得出结论，通过利用多个媒介探针与一个共享的分子信标报告系统，可以设计出多重5'-FEN PCR检测方案。只要释放的媒介引物能够产生可区分的Tm值，即使这些媒介引物的结合位点存在部分重叠，也不会影响检测结果。

构建MeltArray多重PCR方法

通过精确调控媒介引物与分子信标报告系统之间的结合位置，可以精确控制Tm值。单链DNA延伸得越长，其Tm值越高；反之，延伸越短，Tm值越低。Tm值的变化范围是56-91℃，如果将Tm值的间隔设定为大约3℃，那么理论上可以产生12个不同的Tm值。通过调整分子信标报告系统的序列和使用的荧光基团类型，比如Atto425、FAM、HEX、Cy5和Quasar-705等，可以构建多种分子信标报告系统及其对应的媒介序列。

MeltArray的多重检测方案具体如下：该方案涵盖了12种不同的媒介探针，每种探针都含有一个独特的5'-媒介引物序列，这些序列与分子信标报告系统中的特定区域互补。因此，当这12种不同序列的媒介探针与它们的目标序列结合时，相应的酶将水解这些探针，释放出12个媒介引物。这些媒介引物与分子信标系统中的不同位置结合，并进行延伸，产生不同长度的DNA片段。最终，通过熔解曲线分析，结合测得的Tm值和荧光团的颜色，可以同时检测12种不同的靶标。如果荧光定量PCR仪器具备6个荧光通道，那么可以利用六种不同的分子信标报告系统，从而有可能一次性识别多达72个不同的目标序列。

MeltArray技术在SRY基因不孕症检测中的应用

研究者们旨在探究MeltArray技术在高多重PCR检测中的应用潜力，他们通过使用多种不同荧光标记的分子信标报告系统，对20种不同的无精子症相关基因区域（包括AZFa、AZFb、AZFc和AZFd）进行了PCR检测。这些区域的检测采用了三组分别标记有FAM、ROX和Cy5的分子信标报告系统，且每组报告系统都使用了统一的荧光标记。

实验结果显示，所有20个目标区域均能被准确识别，且无论是对单一样本的重复测试还是对多个样本的同时测试，测得的Tm值均展现出极高的一致性。

进一步地，为了评价基因组DNA浓度对MeltArray分析效果的影响，研究者们使用了来自健康男性和女性的基因组DNA进行测试。测试结果表明，从100 ng/反应到100 pg/反应的基因组DNA均能够被MeltArray技术稳定地分析。尽管随着DNA量的减少，熔解峰的高度有所下降，但所有20个峰的Tm值仍然保持稳定不变。

MeltArray PCR检测方法

研究者们对MeltArray技术在高多重PCR检测中的潜力持乐观态度，并相信通过利用荧光定量PCR仪的六个检测通道，能够实现更高通量的PCR分析。基于此，他们开发了一种62重的MeltArray检测方案，旨在区分61个O-抗原生物合成基因，以鉴定54个具有独特O-抗原生物合成基因的O血清群和7个大肠杆菌菌株群（Gp1、Gp2、Gp4、Gp6、Gp9、Gp13和Gp15）。这一62重MeltArray检测是在六色荧光PCR仪上实施的，该仪器能够在指数扩增阶段后进行熔解分析。对于每种不同颜色的荧光团，研究者们使用了8至12个媒介探针，每个探针释放一个具有不同序列的媒介引物，当相应的靶序列结合并扩增时，会产生特定的Tm值。这种MeltArray方法能够产生62种不同的荧光团-Tm值组合，用于鉴定61个O基因型和1个大肠杆菌特异性基因yccT。重复性研究表明，所得Tm值的波动极小，确保了每个潜在目标能够被准确区分。

研究者们进一步应用MeltArray方法对167株大肠杆菌进行了筛选。其中，150株表现出33种不同的O血清型（经常规血清分型确认），而另外17株无法通过常规血清分型揭示其表型。在这150株已知血清型的菌株中，有一株的MeltArray检测结果与传统血清分型结果不一致。然而，这株分离物的MeltArray检测结果得到了全基因组测序（WGS）的验证，证实其分型结果是准确的。这些发现表明，MeltArray检测技术在血清型检测方面比传统血清分型更为精确。此外，MeltArray分析产生的结果与WGS结果高度一致。

 

结论

MeltArray技术以其创新性地结合了媒介探针和分子信标方法，实现了每个荧光通道对12个不同靶标的检测，最多可达72重检测，这标志着qPCR技术的重大飞跃。该技术不仅拓宽了qPCR的应用范围，还成功弥补了低阶PCR与下一代测序（NGS）技术之间的技术空缺，将qPCR的检测能力从低通量提升至中通量水平。

此外，相较于传统MeltPro方法中熔点可能因探针结合区域的突变而发生偏移的问题，MeltArray技术通过精心设计的探针，有效解决了这一挑战。这种技术的先进性在于其高度的多重检测能力，它允许在单管、单步操作中实现对多个靶点的检测，无需额外的酶或单独的反应，极大地提高了检测效率和准确性。

名称	货号	规格
2×Taq PCR Mix	abs60036-1mL×20	1mL×20
200uL PCR 8连管（带盖）	abs7094-1箱	1箱
人自噬作用 PCR Array Panel	LXPH005	84 gene
人纤维化病变 PCR Array Panel	LXPH002	84 gene