DAB染色

电子显微镜成像是生物医学研究中的关键技术，而开发新的标记技术一直是该领域的一个活跃研究方向。Alice Y. Ting实验室在2012年开发了一种基于抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的标记技术，这种技术与传统的辣根过氧化物酶（HRP）相比，能够在更广泛的亚细胞区域内保持活性，不受细胞内蛋白质定位的限制。2015年，该实验室通过酵母表面展示技术对APEX进行了优化，开发出了活性更强的APEX2。

APEX/APEX2技术基于过氧化物酶催化的DAB染色方法，该方法在过氧化氢存在时能够催化DAB聚合，形成聚合物，这些聚合物可以被OsO4染色，实现标记效果。与HRP相比，APEX/APEX2没有二硫键和钙结合位点，因此能够在HRP无法发挥作用的低钙环境中保持活性。

APEX/APEX2技术可以用于标记多种细胞器和亚细胞结构，包括线粒体、内质网、细胞核等。APEX2的分子量为28 kDa，可以轻松地与目标蛋白的N端或C端融合。在细胞固定后，将其置于含有H2O2和DAB的溶液中孵育，随后的锇酸固定和脱水步骤与传统的电镜样品制备方法一致。APEX2催化DAB在局部区域氧化形成亲锇的不溶性聚合物，这些聚合物在电镜下表现为电子密集的黑色颗粒，从而实现高对比度的成像。

图展示了三种不同细胞类型中APEX2标记的细胞切片：MEFs细胞（a）、HeLa细胞（b）和RPE1细胞（c），其中Caveolin蛋白与APEX2融合后的表达情况。

相较于传统的定位技术，如免疫胶体金技术和金属离子配体探针技术，APEX技术提供了一种原位标记的方法，具有高精确度的DAB复合物定位，并且实验操作更为简便，无需经历繁琐的步骤。此外，APEX2与HRP不同，它在管腔、细胞质以及细胞外空间中都能保持活性。然而，正如融合表达荧光蛋白可能存在定位不准确的问题，可能会导致假阳性结果，因此，在实验中设置恰当的阳性和阴性对照对于确保实验结果的准确性至关重要。