利用Trizol试剂高效提取真菌RNA的步骤指南

RNA提取流程概述

1. 初始步骤涉及在PDA培养皿中活化禾谷镰刀菌，待菌株生长成熟后，将它们分别接种到铺有玻璃纸的PDA培养皿中心位置，并在25℃的条件下培养7天。

2. 随后，使用经过灭菌的药勺，将玻璃纸上的菌体轻轻刮下，放置在灭菌滤布上。通过大量的无菌水进行清洗，以确保菌丝的清洁度。清洗完成后，将菌丝压干，并用锡箔纸包裹，放入液氮中进行快速冷冻。冷冻完成后，将菌丝样品储存于-80℃的冰箱中备用。

3. 在进行RNA提取前，需要对菌丝样品进行液氮研磨。研磨完成后，将样品转移到无RNA酶的2ml离心管中，并加入1ml的Trizol试剂。利用涡旋混匀仪对样品进行充分混匀，然后在25℃下静置10-15分钟，期间避免晃动离心管。

4. 接下来，向离心管中加入200μl的氯仿，通过上下颠倒的方式混匀15-30秒。随后，在10000rpm的条件下进行冷冻离心10-15分钟。

5. 离心完成后，小心吸取上层清液，并将其转移到新的无RNA酶的2ml离心管中。然后加入等体积的异丙醇，室温下静置10-15分钟。

6. 静置完成后，在10000rpm的条件下再次进行冷冻离心10-15分钟。离心结束后，倒掉上清液，并向离心管中加入1ml的75%乙醇，用于洗涤沉淀。

7. 在7500rpm的条件下进行冷冻离心5分钟。离心结束后，倒掉上清液，并吸净残留的液体。将离心管置于超净工作台内吹干。最后，加入200μl的DEPC水溶解RNA，备用。

RNA纯化

1. DNA酶处理：
   • 在1.5ml离心管内，加入20μg的RNA提取物。
   • 加入10μl的RQ1 Dnase Reaction buffer和30μl的Dnase，以去除RNA中的DNA污染。
   • 补加DEPC水至总体积为100μl，确保反应体系的稳定性。
   • 在37℃下反应30分钟，使DNA酶充分作用。
2. 有机溶剂萃取：
   • 反应完成后，向离心管中加入400μl的DEPC水，以稀释反应体系。
   • 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液（比例为25:24:1），该混合液能有效萃取RNA并去除杂质。
   • 上下颠倒混匀15-30秒，确保有机溶剂与RNA溶液充分接触。
   • 在10000rpm的条件下进行冷冻离心10-15分钟，使溶液分层。
3. 氯仿再次萃取：
   • 吸取上层清液（含有RNA）转移至新的1.5ml离心管中。
   • 加入等体积的氯仿，进行第二次萃取，以进一步去除杂质。
   • 上下颠倒混匀15-30秒，然后在10000rpm的条件下进行冷冻离心10-15分钟。
4. RNA沉淀：
   • 吸取上层清液转移至新的1.5ml离心管内。
   • 加入双倍体积的无水乙醇，使RNA沉淀下来。
   • 在室温下静置60分钟，让RNA充分沉淀。
5. 离心与洗涤：
6. • 在10000rpm的条件下进行冷冻离心5-10分钟，使RNA沉淀于离心管底部。
   • 倒掉上清液，分别用75%和100%的乙醇清洗沉淀，以去除残留的有机溶剂和杂质。
7. 干燥与溶解：
   • 将离心管置于超净工作台内吹干，确保RNA沉淀完全干燥。
   • 加入30μl的DEPC水溶解RNA，备用。

通过以上步骤，可以得到较为纯净的RNA样品。需要注意的是，在整个纯化过程中，应严格防止RNase的污染，所有耗材和试剂应为无RNase处理的，操作人员应佩戴手套并定期更换。此外，RNA对降解极为敏感，因此提取和纯化过程应尽可能快速，以减少降解风险。最后，得到的RNA样品可以储存于-80℃以下的环境中，以避免降解。