蛋白免疫印迹（Western Blot）

摘要： 本文详细介绍了蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）的原理、操作步骤、常见问题分析及应用领域。WB 是一种广泛应用于蛋白质分析的技术，通过电泳分离蛋白样本，再利用特异性抗体进行检测，能够实现对目标蛋白的定性和定量分析。本文旨在为研究人员提供一份全面的 WB 操作指南，帮助其成功完成实验并深入理解该技术的原理和应用。

一、引言

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的实验方法，利用抗原抗体的特异性反应，通过电泳分离、转膜和免疫检测等步骤，实现对目标蛋白的识别和分析。WB 技术因其高特异性和灵敏度，成为蛋白质研究领域的重要工具，广泛应用于基础研究、疾病诊断和药物开发等方面。

二、WB 的基本原理

WB 的核心原理是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子量大小分离蛋白样本，再将蛋白转移到杂交膜上，通过一抗和二抗的特异性结合实现对目标蛋白的检测。在电泳过程中，蛋白样品在 SDS 的作用下变性，形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，其迁移率主要取决于蛋白的分子量。转膜后，蛋白固定在膜上，通过抗体的识别和显色反应，实现对目标蛋白的可视化检测。

三、WB 的操作步骤

（一）蛋白样本提取制备

细胞或组织裂解：细胞裂解采用预冷的裂解液，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，通过细胞刮子收集细胞，温和转移至离心管中，4℃摇动 30 分钟后离心，收集上清液即为蛋白样本。组织裂解则将组织块在液氮中研磨后，加入裂解液，4℃摇动 2 小时，离心收集上清液。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂：使用 PMSF 作为蛋白酶抑制剂，工作浓度为 1mM，现配现用，防止蛋白降解。同时加入磷酸酶抑制剂，确保磷酸化蛋白的完整性。
蛋白定量：采用 BCA 法进行蛋白定量，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准曲线，通过比色测定计算蛋白浓度。
电泳上样样品的准备：将蛋白样本与 5×SDS 凝胶还原型加样缓冲液混合，95-100°C 煮沸 5 分钟，进行变性和还原处理，使蛋白样品适合电泳分析。

（二）电泳

PAGE 胶的制备：根据蛋白大小选择合适的凝胶浓度，配制分离胶和浓缩胶。分离胶的浓度根据目标蛋白的分子量选择，一般为 8%-15%，浓缩胶浓度为 4%-5%。
蛋白分子量 Marker：使用预染或非预染的蛋白分子量标准，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。
阳性对照和内参对照：设立阳性对照和内参对照，确保实验体系的正确性和有效性。内参蛋白如 β-actin、GAPDH 等，用于检测实验过程及体系是否正常工作。
上样与电泳：将蛋白样本加入到电泳胶的加样孔中，根据蛋白大小选择合适的上样量，一般为 30μg。电泳时，先使用低电压（80V）进行浓缩胶的电泳，再使用高电压（120V）进行分离胶的电泳，直至溴酚蓝到达胶的底端。

（三）转膜与显色

胶中蛋白的检测：电泳后可采用锌染、胶染或考马斯亮蓝染色检测蛋白是否迁移正确与平均。锌染法为可逆染色，适用于后续转膜操作。
蛋白转膜：选择合适的杂交膜，如硝酸纤维素膜（NC）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF），根据蛋白分子量选择膜的孔径。转膜方式分为半干和湿转两种，湿式转膜适用于分子量大于 100kD 的蛋白。
膜上蛋白的检测：丽春红染色：转膜后，使用丽春红染色检测膜上的蛋白条带，确认转膜是否成功。
膜的封闭：用封闭液（如 5% 脱脂奶粉或 BSA）封闭膜上的非特异性结合位点，减少抗体的非特异性结合。
一抗和二抗的孵育：将膜依次与一抗和二抗孵育，一抗针对目标蛋白，二抗带有酶标记，用于后续的显色反应。孵育时间一般为 1-2 小时，可在室温或 4℃进行。
显色：采用化学发光法进行显色，将膜与发光液接触，通过 X-光片曝光并采集图像，实现对目标蛋白的检测。

四、常见问题分析与解决方案

在 WB 实验中，常见的问题包括条带模糊、背景高、无信号等。条带模糊可能是由于转膜不充分或抗体孵育不均匀导致，可通过优化转膜条件和确保抗体孵育均匀解决。背景高可能是由于封闭不充分或抗体浓度过高，可尝试更换封闭剂或降低抗体浓度。无信号可能是由于样本中目标蛋白含量低或抗体不识别蛋白，可增加样本上样量或更换抗体。

五、WB 的应用领域

WB 技术在多个领域具有重要应用。在医学研究中，WB 用于检测疾病相关蛋白的表达变化，如肿瘤标志物、神经退行性疾病相关蛋白等，为疾病的诊断和治疗提供依据。在生物学研究中，WB 用于分析蛋白质的表达调控、信号转导通路等，揭示生命现象的分子机制。此外，WB 技术还应用于药物开发、生物制品质量控制等领域，具有广泛的应用前景。

六、结论

蛋白免疫印迹（Western Blot）作为一种成熟的蛋白质分析技术，以其高特异性和灵敏度，在生命科学研究中发挥着重要作用。通过本文的详细介绍，研究人员可以全面了解 WB 的原理、操作步骤和应用领域，为实验设计和结果分析提供有力支持。在实际操作中，严格遵循标准操作流程，注意细节和常见问题的解决，能够有效提高实验的成功率，为科学研究提供可靠的实验数据。

名称	货号	规格
WB 4101 hydrochloride	abs814961-25mg	25mg
ECL Select WB Detection Reagent	RPN2235	50ml+50ml
MACSxpress WB Starting Kit	130-101-319	EA
MACSxpress WB Neutrophil Iso. Kit, h	130-104-434	EA

蛋白免疫印迹（Western Blot）：原理、操作与应用

蛋白免疫印迹（Western Blot）