酶联免疫吸附测定（ELISA）：原理、应用与技术进展

酶联免疫吸附测定（ELISA）

一、引言

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种对目的分子（如肽、蛋白、抗原、抗体和小分子等）进行定性或定量检测的方法，也是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一。鉴于其强大的特异性和便捷性，ELISA通常被视为生物样品定量检测的金标准。ELISA的原理是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应来判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng/mL）水平甚至皮克（pg/mL）水平。

二、ELISA的原理

1971年，Engvall和Perlmann发表了ELISA用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

三、ELISA的分类方法

ELISA主要分为以下三种类型：

夹心法：常用于检测大分子抗原。将具有专一性的抗体固着于塑胶孔盘上，加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结。洗去多余待测检体后，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结。最后加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。

间接法：常用于检测抗体。将已知的抗原固着于塑胶孔盘上，加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。洗去多余待测检体后，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。最后加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量，从而测量待测抗体的含量。

竞争法：一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原。将具有专一性的抗体固着于塑胶孔盘上，加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结。加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结。由于塑胶孔盘上固着的抗体数量有限，当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固着抗体就越少。洗去检体与带有酶的抗原后，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。

四、ELISA的进展

80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。

五、ELISA的结果判断

定性测定：定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。“阳性”表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性”则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

定量测定：ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

六、ELISA的应用领域

临床诊断：ELISA广泛用于病毒感染、过敏测试、毒性和癌症的诊断检测，是一种快速便捷的临床检测手段。例如，人绒毛膜促性腺激素（hCG）是怀孕时产生的一种激素，可以通过ELISA在尿液样品中检测。此外，指示自身免疫性疾病的标志物，如类风湿性关节炎和红斑狼疮，也可通过ELISA测定和定量。

药物研究：ELISA在药物的研发与监测中发挥着重要作用，可用于筛选化合物库，以确定其与特定蛋白质的结合能力，从而识别潜在的候选药物以供进一步开发。同时，ELISA可用于监测血液或尿液中的药物或其代谢物的水平，以确保药物处于治疗水平且无毒性。

生命科学基础研究：ELISA可以帮助研究人员了解细胞和组织中蛋白质的表达和调控，如磷酸化特异性和总蛋白评估、分泌蛋白表达、翻译后修饰评估、免疫学研究、神经学研究、癌症研究等。

法医药物检测：ELISA检测可被毒理学家用于筛选法医样品中的滥用药物痕迹，包括安非他命、可卡因、鸦片制剂、美沙酮、苯并二氮杂卓和大麻素。虽然液体样品，如尿液或血液比较容易处理，但也可以对固体样品，如头发，进行ELISA分析。

生物仿制药和生物制药检测：随着生物仿制药的发展，有必要证明它们与它们要模仿参考药物之间的相似性。在这里，ELISA也发挥了在确定药物总浓度和检测杂质等因素方面的效用。

七、ELISA的操作步骤

以双抗夹心法ELISA为例，实验步骤如下：

样本准备：ELISA实验适用于各种样品类型（如血液、尿液和裂解细胞），样品制备方法取决于样品类型以及待解决的实验问题。样品制备环节对实验结果影响重大，需要尤为注意。

操作步骤：

包被抗体：用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS），将包被抗体稀释到一定的浓度，100 μl/孔包被，37℃ 2h 或者 4℃过夜。

洗板：弃孔内液体，甩干，10 mM PBST(10 mM PBS+0.05% Tween-20) 洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μl/孔，甩干。

封闭：含1%BSA或者5%脱脂牛奶的10 mM PBST做封闭液，350-400μl/ 孔，37℃ 2h。

洗板：同上。

加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。酶标板加上覆膜，37℃反应60 min-120 min。

洗板：同上。

加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用 PBST 稀释到一定的稀释度。

洗板：同上。

加二抗：根据实验需要，将二抗用10 mM PBST稀释到一定的稀释度。

洗板：同上。

显色：每孔加TMB显色液100 μl，室温避光显色15-20 min，显蓝色，若颜色偏浅，可放在37℃显色，不超过30 min。

终止：每孔加终止溶液100 μl，此时蓝色变为黄色。

酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值），在加终止液后5 min内进行读数。

结果判断：

每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值。

以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。

八、结论

酶联免疫吸附测定（ELISA）作为一种经典的免疫学检测技术，因其高特异性、高灵敏度和操作简便等优点，在临床诊断、药物研究和生命科学基础研究等领域得到了广泛应用。随着技术的不断进步，ELISA在检测灵敏度和特异性方面得到了进一步提升，为生命科学研究提供了有力的工具。

 

名称	货号	规格
IP6K3 (D9O7J) Rabbit mAb	54322T	20μl
Rabbit anti-IP6K3 Polyclonal Antibody(N-term)	abs103309-50ul	50ul
Mouse anti-SDHB Monoclonal Antibody(MM020)	abs145578-100ul	100ul
Rabbit anti-IPO7 Polyclonal Antibody(N-term)	abs110324-50ul	50ul