Biacore

膜蛋白作为细胞膜上的关键分子，扮演着细胞的“守护者”、“运输者”及“信息传递者”等多重角色，其功能的异常与肿瘤、神经退行性疾病、炎症等多种重大疾患密切相关。据相关报道，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子药物中，超过60%以膜蛋白作为靶点，而在抗体药物中，膜蛋白靶标的比例也超过了半数，彰显了膜蛋白作为药物靶点的重要性和主导地位。

在天然的细胞环境中，膜蛋白与细胞膜的脂双层结构相互依存、密不可分。然而，在靶点研究与药物开发过程中，往往需要将膜蛋白从细胞膜上分离并纯化出来。膜蛋白的制备技术多种多样，包括去垢剂抽提法、病毒载体法、人造脂质膜法以及聚合物稳定技术等。其中，利用苯乙烯马来酸（SMA）共聚物制备蛋白纳米颗粒的技术尤为独特，它无需使用去垢剂，而是通过识别并结合膜蛋白周围的内源性脂质，将目标蛋白提取至SMA脂质颗粒（SMALP）中，从而使蛋白得以保留在接近天然的脂质双层环境中。

小分子抑制剂筛选及检测方法

小分子抑制剂的筛选及检测是药物研发中的重要环节。针对SMALP（苯乙烯马来酸脂质颗粒）等脂质囊泡，Biacore技术凭借其独有的L1芯片，通过疏水修饰的基团实现脂质体的有效捕获，为膜蛋白靶点与抗体、化合物等各类药物分子的筛选及亲和力检测提供了有力工具。第二军医大学药学院与浙江省食品药品检验研究院的研究团队，创新性地结合了SMALP技术与Biacore L1芯片，以膜蛋白P-glycoprotein为研究对象，开发了一种基于Biacore L1芯片的、无需标记且无需去垢剂的膜蛋白小分子抑制剂筛选及检测方法。该方法从多个维度验证了其可靠性，相关研究成果已发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上。

在天然状态下，膜蛋白与细胞膜脂双层紧密相连，而在靶点研究和药物开发中，往往需要将膜蛋白从细胞膜上分离并纯化。膜蛋白的制备技术多种多样，包括去垢剂抽提法、病毒载体法、人造脂质膜法以及聚合物稳定技术等。其中，利用SMA（苯乙烯马来酸）共聚物制备蛋白纳米颗粒的技术尤为独特，它无需使用去垢剂，而是通过识别并结合膜蛋白质周围的内源性脂质，将目标蛋白质提取到SMA脂质颗粒（SMALP）中，从而使蛋白质得以保留在接近天然的脂质双层环境中。

 

研究路线

 

P-glycoprotein (P-gp) 是一种分子量为170 KD的跨膜糖蛋白，具有能量依赖性的“药泵”功能，能将细胞内药物主动泵出，从而降低胞内药物浓度，导致细胞产生耐药性。P-gp的高表达是众多肿瘤细胞产生多重耐药性的重要因素之一，因此，P-gp被视为一个潜在的逆转耐药性的靶点。本研究选取了高表达P-gp的MCF-7/ADR（人乳腺癌阿霉素耐药细胞株）及其对照细胞MCF-7，通过多步离心法提取细胞膜，并制备了苯乙烯马来酸脂质颗粒（SMALP）。随后，采用Western Blotting (WB) 和酶联免疫吸附试验（ELISA）对SMALP中的P-gp进行了验证。

接着，研究者选择了Biacore L1芯片，在实验通道上特异性地捕获了来自MCF-7/ADR细胞的SMALPs（SMALPs-MCF-7/ADR），而在参比通道上捕获了相当量的来自MCF-7细胞的SMALPs（SMALPs-MCF-7）。通过使用单一浓度的阳性对照化合物、阴性对照化合物以及阳性对照抗体，对P-gp-SMALPs-L1芯片的特异性和活性进行了验证。在明确了芯片的特异性和活性后，研究者进一步检测了SMALPs-MCF-7/ADR与阳性对照药物valspodar的准确亲和力，并使用参比分子对方法的可靠性进行了验证。

使用Biacore L1芯片检测SMALPs-MCF-7/ADR与valspodar的亲和力

 

Biacore L1芯片在P-gp抑制剂筛选中展现高效性能

为开发新型的P-gp（P-糖蛋白）抑制剂，本研究选取了50种天然产物，并利用P-gp-SMALPs-L1芯片对其与P-gp的结合水平进行了筛选。最终，成功筛选出了包括Tetrandrine在内的9种具有潜在抑制活性的化合物。

针对P-gp-SMALPs-L1芯片的筛选方法，本研究有以下两点重要发现：

1. 相较于传统的基于细胞的P-gp抑制剂筛选方法，该方法显著缩短了筛选时间。传统方法耗时数天，而利用Biacore L1芯片的方法仅需数小时即可完成筛选，且特异性良好，提高了筛选效率。

2. SMALP（苯乙烯马来酸脂质颗粒）中的P-gp呈非定向分布，这使得P-gp-SMALPs SPR（表面等离子体共振）筛选方法能够同时筛选出靶向P-gp胞内域及胞外域的化合物，为P-gp抑制剂的开发提供了更全面的筛选策略。

使用P-gp-SMALPs-L1 chip进行药物筛选

 

在筛选得到9种候选化合物后，作者运用Biacore技术，对SMALPs-MCF-7/ADR与这9种化合物的准确亲和力进行了细致检测。实验结果表明，这9种化合物均展现出良好的结合能力，从而有力地验证了筛选方法的可靠性。在评估结合能力时，作者不仅关注了解离常数（KD）这一关键指标，还综合考虑了最大响应值（Rmax）等更多结合信息，以确保评估的全面性和准确性。

P-gp（P-糖蛋白）抑制剂具有潜在的逆转肿瘤耐药性作用。为验证这一假设，作者通过细胞实验，分别评估了几种化合物在逆转耐药性及抑制P-gp“药泵”功能方面的效果。实验结果显示，包括tetrandrine（汉防己甲素）在内的几种化合物均显著抑制了P-gp的活性，这一发现与已报道的tetrandrine能够促进细胞中药物积累的结果相一致（见图4）。细胞实验的结果不仅为P-gp抑制剂的潜在作用提供了有力证据，也进一步验证了P-gp-SMALPs-SPR（基于表面等离子体共振的P-gp-苯乙烯马来酸脂质颗粒筛选）筛选及检测方法的可靠性。

P-gp抑制剂的逆转耐药性检测及活性抑制检测

总结

综上所述，作者成功利用Biacore技术建立了一种无需标记且无需去垢剂的膜蛋白药物筛选及检测方法。该方法通过制备具有更天然构象的膜蛋白-SMALP复合物，并借助Biacore L1芯片实现膜蛋白的有效捕获，从初步筛选到精准亲和力表征，全程运用Biacore技术，最终发现了具有潜在逆转抗药性的新型小分子抑制剂。此研究首次将SMA膜蛋白稳定技术与表面等离子体共振（SPR）技术相结合，应用于复杂膜蛋白靶点的药物筛选及亲和力检测，并成功获得了有效的潜在抑制剂。

膜蛋白研究领域复杂多变，如何简化研究流程，开发既准确又高效的研究方法，是科研工作者面临的重要课题。Biacore作为经典的体外相互作用技术，其针对各类型生物分子开发的传感芯片，无需样品预处理即可满足多种生物分子的相互作用检测需求，已成为科研工作者在基础科研及药物开发领域的得力工具。

 

 

名称	货号	规格
BIACORE 8K Maintenance chemicals	29229054	1套
Biacore Maintenance Kit	BR100667	EA
Biacore Basics, 5-pack	BR300015	EA
Biacore Maintenance Kit, type 2	BR100651	EA