FITC简介

中文名称：异硫氰酸荧光素

外文名：Fluorescein isothiocyanate isomer I

别称：异硫氰酸荧光橙红、异硫氰酸荧光黄、异硫氰酸荧光红、异硫氰酸荧光素异构体 I、5 - 异硫氰酸荧光素

化学式：C₂₁H₁₁NO₅S

分子量：389.39

CAS登录号：27072 - 45 - 3

熔点：高于360℃

水溶性：易溶于水和乙醇

外观：黄色至橙黄色结晶性粉末

应用：作为一种重要的荧光标记试剂，广泛应用于蛋白和抗体的标记，在细胞表面抗原检测、细胞凋亡检测以及体外诊断试剂制备等领域应用广泛。

FITC标记抗体的原理

在碱性环境（pH 8.5以上）中，FITC的异硫氰酸基团能够与免疫球蛋白分子中的赖氨酸残基发生反应。具体而言，FITC的异硫氰酸基团在水溶液中与免疫球蛋白的赖氨酸的ε-氨基发生碳酰胺化反应，形成稳定的硫碳氨基键，从而生成标记有荧光素的免疫球蛋白，即荧光抗体。每个免疫球蛋白分子上理论上最多可结合15至20个FITC分子，这使得荧光标记后的抗体在检测应用中具有较高的灵敏度和特异性。

FITC标记抗体的方法

在荧光抗体标记技术中，常用的方法包括Marshall（1958）法、Chadwick法以及Clark等（1963）的透析标记法。其中，Marshall法是一种经典的标记方法，被广泛应用于荧光抗体的制备。此外，根据具体的实验条件和需求，Chadwick法和Clark等的透析标记法也可作为可选方案，用于FITC标记抗体的制备。

FITC标记抗体的过程

一、材料

抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25~50mL）、冰及冰槽（或1000mL烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透吸袋、玻棒、棉线及烧杯（500mL）、pH7.2或pH8.0的0.01mol/L PBS等。

二、操作过程

（一）抗体的准备

取适量已知浓度的抗体溶液，置于三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最终抗体浓度为20mg/mL，缓冲液总体积为反应体系总体积的1/10，充分混匀。将三角烧瓶置于冰槽中，使用电磁搅拌器以适当速度搅拌（避免产生泡沫），持续5~10min。

（二）荧光素的准备

根据待标记蛋白的总量，按照每毫克蛋白加入0.01mg荧光素的比例，使用分析天平精确称取所需量的异硫氰酸荧光素粉末。

（三）标记

在持续搅拌抗体溶液的同时，将称取的异硫氰酸荧光素粉末缓慢加入抗体溶液中，确保荧光素粉末充分分散，避免其黏附于三角烧瓶壁或搅拌棒上（整个加入过程约持续5~10min）。荧光素添加完毕后，继续搅拌12~18h，期间将蛋白质溶液保存于4℃冰箱或冰库中，以维持反应体系的低温环境。

（四）透析

标记反应完成后，将标记后的抗体溶液以2500rpm离心20min，去除可能产生的少量沉淀物。随后，将上清液转移至透析袋中，置于烧杯内，使用pH8.0的缓冲盐水在0~4℃条件下进行透析，以去除未反应的荧光素和其他小分子杂质。

（五）过柱

取透析后的标记物，通过Focudex G-25或Focudex G-50柱进行凝胶过滤，以进一步纯化标记物，去除未结合的荧光素和盐分等杂质，实现对标记抗体的体系置换。最后，将纯化后的标记抗体分装，并贮存于4℃冰箱或冰库中，以保持其活性和稳定性。

FITC标记抗体的保存

FITC标记抗体应于4℃或-20℃条件下低温保存，以有效防止抗体活性降低及蛋白质变性。为延长保存期限，建议添加防腐剂，如浓度为（1:5000）~（1:10000）的硫柳汞，或（1:1000）~（1:5000）的叠氮钠。在分装时，可采用小量分装方式，如每份0.1~1mL，分装后可置于真空干燥环境中保存，此法更利于标记抗体的长期稳定性。

FITC标记抗体的应用

FITC标记抗体在多种免疫检测技术中具有广泛应用，主要包括以下方面：

一、免疫荧光技术

在免疫荧光技术中，FITC标记抗体是关键的荧光标记物。当其与待检样本中的特异性抗原结合后，通过荧光显微镜观察，可发出明亮的黄绿色荧光。这一特性使其在细胞表面抗原检测、细胞凋亡检测以及组织病理学研究等领域成为不可或缺的工具。例如，在流式细胞术中，FITC标记抗体能够快速、准确地识别并标记目标细胞表面的特定抗原，从而实现对细胞类型、细胞周期以及细胞内信号通路的分析。

二、酶联免疫吸附（ELISA）

在ELISA检测中，FITC标记抗体可用于间接法或夹心法等检测模式。通过将FITC标记抗体与酶标二抗相结合，利用酶促反应产生的颜色变化来定量检测样本中的抗原或抗体。这种方法具有高度的灵敏度和特异性，广泛应用于临床诊断、食品安全检测、环境监测等领域。

三、放射免疫测定

在放射免疫测定中，FITC标记抗体可以与放射性核素标记的抗原或抗体竞争结合，通过检测放射性强度来定量分析样本中的目标物质。由于其高灵敏度和特异性，放射免疫测定在激素、药物、蛋白质等生物活性物质的检测中具有重要应用价值。

四、免疫印迹（Western blot）

在Western blot实验中，FITC标记抗体作为二抗与一抗结合，通过荧光成像系统检测目标蛋白的表达水平和分子量大小。与传统的化学发光法相比，荧光检测具有更高的灵敏度和更宽的线性范围，能够实现对低丰度蛋白的精确检测。此外，荧光成像系统还支持多色荧光检测，便于同时分析多个目标蛋白。

名称	货号	规格
FITC标记的抗人CD5单克隆抗体克隆号L17F12 无证	340696	100T
FITC标记的抗人CD33单克隆抗体克隆号P67.6 无证	340678	50T
FITC标记荆豆凝集素I	abs47038952-100ug	100ug
FITC标记的抗人CD14单克隆抗体克隆号MφP9 无证	340682	100T

FITC标记抗体：原理、方法