肠道固有层免疫细胞分离制备指南

1、实验前准备：

试剂准备

40% Percoll溶液配制：
Percoll 细胞分离液与 PBS 缓冲液（10×）按体积比 9:1 混合，配制等渗 100% Percoll 母液。用 100% Percoll 母液和 RPMI 1640/1×PBS 按体积比 4:6 混合，配制 40% 等渗 Percoll 溶液。

 

80% Percoll 溶液：
Percoll 细胞分离液与 PBS 缓冲液（10×）按体积比 9:1 混合，配制等渗 100% Percoll 母液。用 100% Percoll 母液和 RPMI 1640/1×PBS 按体积比 8:2 混合，配制 80% 等渗 Percoll 溶液。

 

2、肠道固有层免疫细胞分离步骤操作步骤：

 

1、颈椎脱臼法处死小鼠并固定在手术台上，75%酒精消毒小鼠腹部，于正中纵行剪开暴露腹腔；
2、如下图所示，在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，一边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，一边拉出小肠，之后在小肠和盲肠连接处剪断，从而分离出小肠。

 

小鼠肠道组织解剖图

3、10 cm 培养皿中加入5 mL 4°C 预冷的 PBS，将步骤 2 中的小肠放入培养皿润洗，使用镊子和剪刀依次去除脂肪组织和派伊尔结。
 

小鼠派伊尔结去除操作图

A. 去除表面脂肪和肠系膜等组织的小肠，红色箭头指示派氏结（平均每只小鼠有 6-9 个派氏结）；
B. 剪去派氏结的操作示意图；
C. 去除派氏结后的小肠，红框是所有剪下来的所有派氏结。

小鼠派伊尔结（Peyer's patches，PPs）是小鼠肠道黏膜免疫系统的重要组成部分，主要分布在小鼠小肠的下部，即远端空肠和回肠，与小鼠固有层免疫细胞的组成和功能有显著差异，在分离小鼠肠道免疫细胞时，去除派伊尔结是为了确保获得更纯净、更具代表性的目标细胞群体，从而提高实验结果的可靠性。
4、将小肠切成 4 段，用剪刀纵向剪开小肠（不必沿着肠系膜方向），暴露出肠内容物，轻轻地将肠内容物从粘膜表面刮除；
5、将小肠转移到含有 10 mL HBSS + 2% FBS 的 50 mL 离心管中，剧烈涡旋 10-20 秒；
6、用镊子取出小肠重复清洗 2 次；

7、将清洗过的肠组织，剪碎成 0.5 cm 的小片段，将组织块（100-200 mg）转移到 2 mL 圆底管中，加入 1 mL 小鼠肠道组织解离液（abs50093），37 °C 水平摇床轻轻摇晃孵育 60 min（根据组织糜烂状态适当延长孵育时间）；
8、从水平摇床中取出圆底管，剧烈涡旋 10-20 秒，通过 70 μm 细胞筛网（abs7232）过滤，用 10 mL PBS 冲洗细胞筛网；
9、收集含有细胞的滤液到 50 mL 管中，20 °C 下 400 g 离心 5 min，弃上清液，用 4 mL 40% percoll（abs9102）重悬细胞沉淀并转移到 15 mL 离心管；10、吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 离心管底部，试管稍微倾斜，将 4 mL 40% percoll 与细胞的混合液沿着管壁缓慢加入离心管，覆盖在 80% percoll 溶液的顶部形成密度梯度；

 注意：不要破坏 80% percoll 和 40% percoll 与细胞的悬浮液的分界面，40% 和 80% percoll 现配现用。

 

11、800 g 20 °C 离心 20 min，升速（ACC）1，降速（DEC）1；

 

Percoll 分离组织免疫细胞示意图

分离图片参考自文献 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327

12、离心结束后，吸取中间白膜层免疫细胞至新的 15 mL 离心管中，加入 3 倍体积 4°C 预冷 PBS，上下颠倒混匀，4 °C 下 400 g 离心 5 min，弃上清；
13、按照步骤 12 重复清洗一次，弃上清得到肠道固有层淋巴细胞；
14、细胞染色缓冲液（abs9475）重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至 5-10×106 cells/mL，将 100 μL/管的细胞悬液分配到 12×75 mm 的流式管（abs7303）中用于后续实验操作。

 

3、流式实验结果图

 

 

4、相关产品推荐

 

用途	品名	货号	规格
保存组织	组织保存液	abs9474	100mL
消化组织酶	小鼠肠道组织解离试剂盒	abs50093	25T
富集细胞	细胞分离液	abs9102	100mL
筛网	70um 细胞筛网	abs7232	100 个
流式管	5mL 流式管（无菌无酶，带帽）	abs7303	500 个
染色缓冲液	细胞染色缓冲液	abs9475	500mL

 

更多流式好物推荐

 

货号	产品名称	规格
abs9907	流式绝对计数管	50T
abs9477	小鼠 Fc 受体阻断剂	200T/500T
abs9476	人 Fc 受体阻断剂	50T/200T
abs9488	鞘液	20L
abs9107	佛波酯	1mg/5mg/25mg
abs9108	离子霉素钙盐	1mg/5mg
abs970	D-PBS缓冲液（1×，无钙镁）	500mL
abs810012	Brefeldin A	10mg/25mg/50mg
abs812975	Monensin sodium salt	25mg/100mg
abs9110	固定剂	50mL
abs9111	破膜剂	150mL
abs7303	5mL流式管（无菌无酶，带盖）	1箱
abs1840002	APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9)	25T/100T
abs182427	PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4)	25T/100T
abs182430	FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4)	25T/100T
abs180046	PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96)	25T/100T
abs1840696	FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4)	25T/100T
abs182338	APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5)	25T/100T