PCR技术基本原理

DNA的半保留复制（semi-conservative replication）是指在DNA复制过程中，原有的DNA双链会分离，每条单链分别作为模板，合成新的互补链，从而形成两个新的DNA分子。每个新形成的DNA分子都包含一条来自亲代的原始链和一条新合成的链。这种复制方式保证了遗传信息的稳定传递，是细胞分裂和基因遗传的重要基础。

DNA复制过程

DNA复制过程可以分为以下几个阶段：

解链：DNA双螺旋结构在拓扑异构酶和解旋酶的作用下被解开，形成两条单链DNA，构成“复制叉”。拓扑异构酶通过切割DNA的一条链或双链，释放DNA复制和转录过程中产生的张力，去除复制叉前端产生的正超螺旋，再将切割形成的断端连接成完整的DNA链。解旋酶则是利用ATP的化学能在复制叉处分离两条DNA亲本链。

引物合成：单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，稳定单链DNA，阻止DNA复性，避免被核酸酶降解。引物酶（一种依赖DNA的RNA聚合酶）以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物，以提供自由的3'-OH，形成引发体，使子代DNA链能够开始聚合。

链延伸：DNA聚合酶沿着模板链合成新的互补DNA链。由于DNA双链是反向平行的，因此新链的合成方向是相反的。在前导链上，DNA聚合酶可以连续合成新链；而在后随链上，合成是以小段（称为冈崎片段）的形式进行，这些片段随后由DNA连接酶连接起来。

引物去除和缺口修补：RNA引物被去除，缺口由DNA聚合酶填补，最后由DNA连接酶将新合成的片段连接起来。

PCR技术及其原理

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。

DNA体外复制的所需条件

模板和底物：DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）为底物合成子代DNA。

引物：DNA聚合酶必须以一段具有3'-OH的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物。

模板双链的解旋：在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解旋酶的作用下完成的。而在体外扩增特定的核酸片段时，需要通过加热使模板DNA变性为单链DNA。

DNA的变性、复性和延伸

变性：对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值。DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm)。

复性：加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火”。当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果最佳。

延伸：在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与。科学家从水生栖热菌（Thermus Aquaticus）中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。

PCR反应体系和条件

反应体系：100μL的PCR反应体系包括模板DNA、前后引物、Tris-HCl缓冲液、氯化镁、Tween 20、灭菌的明胶或无核酸酶的牛血清蛋白、四种dNTP、KCl和Taq DNA酶。

反应条件：

预变性：95℃，5～10min，使模板DNA分子完全变性同时激活热稳定的DNA聚合酶。

循环反应：进行30次循环“变性-退火-延伸”的PCR反应，包括95℃变性10～30s，引物特定退火温度30s，72℃延伸1min。

最后延伸和终止：在最后一次反应循环结束后，使PCR反应在72℃进一步延伸5～10min，然后将反应混合物冷却到4℃，或加入10mmol/L的EDTA终止反应。

逆转录PCR

逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，之后再进行PCR的过程。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

逆转录反应体系

RNA模板：通常20μL的逆转录体系，加入总RNA 1μg。

引物：常用的有随机引物和Oligo(dT)引物。随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录，而Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配，可以特异性的对mRNA进行逆转录。

逆转录酶：逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程，目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能。

4种dNTPs。

其他PCR技术

RL-PCR：检测蛋白质和RNA在体内的相互作用。

RNA-PCR：检测痕量RNA和低表达的基因。

反向PCR：扩增已知序列两侧的DNA。

RACE：获得mRNA完整序列。

LM-PCR：在模板的一端加上公共接头，这样只需知道一端的DNA序列就可以对任何DNA片段进行扩增。

重叠延伸PCR：对目的基因进行定点突变。

 

 

名称	货号	规格
200uL PCR 8连管（带盖）	abs42078408-50mg	50mg
2×Taq PCR Mix	abs60036-1mL×20	1mL×20
2×HotStart Taq PCR Mix with Loading Dye	abs60032-1mL×5	1mL×5
PCR & DNA 片段纯化试剂盒	abs60167-50T	50T