siRNA：基因沉默的 RNA 干扰技术，研究与应用全解析

特点

1. 长度约为 22 个核苷酸左右。
2. 依赖 Dicer 酶的加工，作为 Dicer 的产物，具备 Dicer 产物的典型特征。
3. 其生成过程需要 Argonaute 家族蛋白的存在。
4. 是 RNA 诱导沉默复合体（RISC）的组成成分。
5. siRNA 的合成是由双链 RNA 或 RNA 前体形成的。
6. 一般情况下，siRNA 是通过人工体外合成，经转染进入人体内，作为 RNA 干涉的中间产物发挥作用；在植物体内也存在内源性的 siRNA。
7. 在结构上，siRNA 为双链 RNA 形式。
8. 在 Dicer 酶的加工过程中，siRNA 对称地来源于双链 RNA 前体的两侧臂。
9. 在作用位置方面，siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位，并且与 mRNA 完全互补。
10. 在作用方式上，siRNA 仅能导致靶标基因的降解，属于转录后水平的调控方式。
11. siRNA 不参与生物的生长过程，它是 RNA 干扰（RNAi）的产物，最初的作用是抑制转座子活性以及抵御病毒感染。

设计问题

1. 从目标基因开放阅读框起始密码子下游的 75 至 100 碱基位置开始，寻找 “AA” 二连序列之后的 19 个碱基序列。（采用非 “AA” 的 “XY” 序列之后的 19 个碱基序列，同样可以得到效果良好的 siRNA。）在设计 siRNA 时，应避免针对 5’ 端和 3’ 端的非编码区。
2. 对获得的序列进行分析，优先选择 GC 比在 40% - 55% 之间的靶基因序列。
3. 将潜在的序列与相应的基因组数据库（如人类、小鼠、大鼠等基因组数据库）进行比对，排除与其他编码序列 / EST（表达序列标签）存在同源性的序列，例如可使用 BLAST 等工具进行比对。
4. 若选择 shRNA（短发夹 RNA），相关报道显示，含有 9 个寡核苷酸的环结构最为有效。

1. 从转录本（mRNA）的 AUG 起始密码子开始，寻找 “AA” 二连序列，并记录其 3’ 端的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶位点。研究结果显示，GC 含量在 30% - 50% 左右的 siRNA 相比 GC 含量偏高的 siRNA 效果更佳。Tuschl 等建议在设计 siRNA 时，避免针对 5’ 端和 3’ 端的非编码区（即非翻译区，UTRs），原因在于这些区域存在丰富的调控蛋白结合位点，UTR 结合蛋白或翻译起始复合物可能会影响 siRNP 核酸内切酶复合物与 mRNA 的结合，进而影响 siRNA 的作用效果。
2. 将潜在的序列与相应的基因组数据库（如人类、小鼠、大鼠等基因组数据库）进行比对，排除与其他编码序列 / EST 存在同源性的序列，例如可使用 BLAST 等工具进行比对。
3. 选出合适的目标序列进行合成。通常，针对一个基因需要设计多个靶序列的 siRNA，以确定最有效的 siRNA 序列。

负对照

制备

体外制备

1. 化学合成 ：许多国外公司可根据用户需求提供高质量的化学合成 siRNA。然而，这种方法的主要缺点包括价格较高、定制周期较长，尤其是对于一些有特殊需求的情况。鉴于其成本较高，若为一个基因合成 3 - 4 对 siRNAs，成本将更高。因此，比较常见的做法是先采用其他方法筛选出最有效的序列，再进行化学合成。
   • 最适用于：在已经找到最有效的 siRNA 的情况下，需要大量 siRNA 进行研究的场景。
   • 不适用于：筛选 siRNA 等需要较长时间的研究项目，主要原因是其价格因素。
2. 体外转录 ：以 DNA Oligo 为模板，通过体外转录合成 siRNAs。相较于化学合成法，其成本相对较低，且能够更快地获得 siRNAs。但该方法的不足之处在于实验规模受到一定限制。虽然一次体外转录合成能够提供足够进行数百次转染的 siRNAs，但反应规模和产量始终存在一定的上限。与化学合成相比，体外转录过程仍需要占用研究人员较多的时间。不过，体外转录得到的 siRNAs 具有毒性小、稳定性好、效率高等优点，仅需化学合成 siRNA 用量的 1/10，即可达到与化学合成 siRNA 相当的效果，从而提高转染效率。
   • 最适用于：筛选 siRNAs，尤其是在需要制备多种 siRNAs 且化学合成的价格成为障碍时。
   • 不适用于：实验需要大量特定的 siRNA，以及长期研究项目。
3. 用 RNase III 消化长片段双链 RNA 制备 siRNA ：其他制备 siRNA 的方法往往需要设计和检验多个 siRNA 序列，以找到一个有效的 siRNA。而采用这种方法，即制备一份含有各种 siRNAs 的 “混合鸡尾酒”，则可避免上述缺陷。通常选择 200 - 1000 碱基的靶 mRNA 模板，通过体外转录的方法制备长片段双链 dsRNA，然后利用 RNase III（或 Dicer）在体外进行消化，得到一种 siRNAs “混合鸡尾酒”。在去除未被消化的 dsRNA 后，该 siRNA 混合物可直接用于转染细胞，其转染方法与单一 siRNA 转染相同。由于 siRNA 混合物中含有众多不同的 siRNAs，通常能够确保目的基因得到有效抑制。
   • dsRNA 消化法的主要优势在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA 序列的步骤，从而为研究人员节省时间和金钱（通常使用 RNAse III 比使用 Dicer 更为经济）。不过，该方法的缺点也较为明显，即有可能引发非特异性的基因沉默，尤其是对同源或密切相关的基因。但目前多数研究表明，这种情况通常不会对实验结果造成显著影响。
   • 最适用于：快速且经济地研究某个基因功能缺失的表型。
   • 不适用于：长时间的研究项目，或者需要特定的 siRNA 进行研究，特别是基因治疗领域。

体内表达

4. siRNA 表达载体 ：大多数 siRNA 表达载体依赖三种 RNA 聚合酶 III 启动子（pol III）中的一种，用以操纵一段小的发夹 RNA（short hairpin RNA, shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括人源和鼠源的 U6 启动子以及人 H1 启动子。之所以采用 RNA pol III 启动子，是因为它能够在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA，并且它是通过添加一串（3 到 6 个）U（尿苷）来终止转录的。要使用这类载体，需要订购两段编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链，进行退火处理后，克隆到相应载体的 pol III 启动子下游。由于涉及到克隆过程，因此整个过程可能需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以确保克隆的序列正确无误。
   • siRNA 表达载体的优点在于可以进行较长期的研究 —— 带有抗生素标记的载体能够在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续时间可长达数星期甚至更久。
   • 病毒载体也可用于 siRNA 表达，其优势在于可以直接高效地感染细胞进行基因沉默研究，避免因质粒转染效率低而带来的诸多不便，且转染效果更加稳定。
   • 最适用于：已知一个有效的 siRNA 序列，需要维持较长时间的基因沉默的情况。
   • 不适用于：筛选 siRNA 序列（主要是因为需要进行多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5. siRNA 表达框架 ：siRNA 表达框架（siRNA expression cassettes，SECs）是一种通过 PCR 得到的 siRNA 表达模板，其中包括一个 RNA pol III 启动子、一段发夹结构 siRNA 以及一个 RNA pol III 终止位点，能够直接导入细胞进行表达，无需事先克隆到载体中。与 siRNA 表达载体不同，SECs 避免了载体克隆、测序等耗时的步骤，可直接通过 PCR 得到，通常在一天内即可完成。因此，SECs 成为筛选 siRNA 的最有效工具，甚至可用于筛选在特定研究体系中启动子和 siRNA 的最佳搭配。如果在 PCR 两端添加酶切位点，那么通过 SECs 筛选出最有效的 siRNA 后，可直接将其克隆到载体中，构建 siRNA 表达载体，进而用于稳定表达 siRNA 和长期抑制研究。
   • 该方法的主要缺点包括：① PCR 产物较难转染到细胞中（晶赛公司的 Protocol 可以解决这一问题）；② 无法进行序列测定，PCR 和 DNA 合成过程中可能出现的误读无法被发现，可能导致结果不理想。
   • 最适用于：筛选 siRNA 序列，以及在克隆到载体前筛选最佳启动子的场景。
   • 不适用于：长期抑制研究（但如果将筛选出的 siRNA 克隆到载体后，则可用于长期抑制研究）。

研究策略

应用