文献解析|王潇/刘如谦团队合成具核酸外切酶抗性的枝状poly(A)尾，增强mRNA药物稳定性

Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA

信使 RNA（mRNA）虽作为疫苗成效显著，但其在通用治疗领域的潜力因稳定性低、翻译能力欠佳而受限。

2024 年 3 月 22 日，麻省理工学院化学系与博德研究所王潇、刘如谦（David R. Liu）团队携手，于《Nature Biotechnology》（IF 47）在线发表题为《Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA》的研究论文（陈泓宇为第一作者）。该研究创新性地设计并合成了带有多种合成型 poly(A) 尾的拓扑结构及化学修饰 mRNA，以延长并提升蛋白表达时长与水平。

实验数据显示，经优化的多尾 mRNA 在细胞转染后 24 至 72 小时内，其发光信号强度为对照组的 4.7 至 19.5 倍；体内转染 14 天后仍可检测到信号，远超对照组的 7 天检测时限。研究团队还成功在小鼠肝脏中，以极低的 mRNA 剂量实现了对临床相关基因 Pcsk9 和 Angptl3 的高效多路基因组编辑。总体而言，本研究为合成带帽分支 mRNA 提供了一种具有显著增强翻译能力的通用方法。

近年来，信使 RNA（mRNA）疗法因具备可编程性、可扩展性以及易于设计和合成等优势而备受关注。2019 年冠状病毒病（COVID - 19）mRNA 疫苗的快速开发对此作了有力证明。例如，在早期临床试验中，mRNA 已用于产生用于治疗心力衰竭的旁分泌血管内皮生长因子，以及用于纠正导致杂合性家族性高胆固醇血症突变的 Cas9 蛋白。用于酶替代、抗体治疗和基因编辑等应用的 mRNA 治疗需要持续的高水平蛋白质生产。然而，传统的 mRNA 药物存在 RNA 不稳定和低表达效率的问题，导致需要高剂量，这可能引发细胞毒性。为应对这些挑战，提高 mRNA 载体的翻译持续时间和整体蛋白质产量成为当务之急。

为扩大 mRNA 药物的应用范围，研究者们做出了诸多努力。例如，用 N1 - 甲基伪尿嘧啶（m1ψ）替代尿嘧啶（U）可阻断 toll 样受体识别，从而降低免疫毒性。此外，非翻译区（UTRs）的密码子优化和序列操作已被证实可以增加蛋白质表达。另一种有望扩大 mRNA 药代动力学窗口的策略是使用环状 RNA（circRNA），其对外切酶切割具有抗性，而外切酶切割是线性 mRNA 降解的主要途径。然而，circRNA 技术在目前的状态下面临一些限制。circRNA 的翻译起始依赖于内部核糖体进入位点（IRES），其效率低于 7 - 甲基鸟苷酸（m7G）帽依赖的翻译起始机制。circRNA 限制了化学修饰的使用，包括 m1ψ，因为这些修饰会阻断 circRNA 合成所需的 RNA 剪接，并消除基于 IRES 的翻译起始。类似的限制也适用于自我扩增的 RNA，其中复制所需的保守序列元素与 m1ψ 不兼容，且生成的复制子无帽，具有免疫原性。因此，需要其他策略来保护 mRNA 转录本免受核酸外切酶依赖的快速衰变，特别是 3' poly(A) 尾部的死基化，同时保留有效的帽依赖翻译起始机制。

在广泛接受的帽依赖翻译机制模型中，限速步骤是真核翻译起始因子（eIF4E 和 eIF4G24）组装以 m7G 帽为中心的翻译起始复合物。该复合物通过 eIF4G 与细胞质聚腺苷酸结合蛋白（PABPCs）相互作用进一步稳定，而 PABPCs 识别 3' poly(A) 尾，形成多聚体复合物和闭环结构。PABPCs 具有双重作用：一方面通过与 eIF 结合启动翻译，另一方面通过掩盖 poly(A) 尾来防止其去腺苷化，从而延长 mRNA 的稳定性。之前的研究已经证明，在 poly(A) 尾中引入位点特异性抗外切酶修饰，可以通过稳定新生的 poly(A) 尾并维持 poly(A)-PABPC1 相互作用，有效增加 mRNA 在细胞中的稳定性和蛋白产量。结构研究表明，PABPC1 是一种多聚体蛋白复合物，其中单个 PABPC1 分子结合 poly(A) 尾，形成稳定的宏观结构。

为实现上述目标，作者开发了一种具有多聚（A）尾部的化学修饰、帽状、分支的 mRNA 寡核苷酸偶联物，称为多尾（multitail）mRNA。研究系统评估了 poly(A) 尾部不同的化学和拓扑模式对 mRNA 翻译能力的影响及其作用机制。该团队已在细胞系和小鼠中成功构建了支链 mRNA，可将蛋白表达延长至 14 天，并在最低剂量下提高了 CRISPR 编辑效率。从更广泛的 RNA 生物化学角度来看，这项研究提供了一种可推广的方法，能够将定义明确但不同的修饰引入 poly(A) 尾部，并表明这些化学和拓扑模式被 mRNA 翻译机制良好耐受。

名称	货号	规格
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DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	69504	50Test
Dual-Glo® Luciferase Assay System	E2920	10ml
QIAamp 96 Viral RNA Kit (10)	52962	10T