文献解析|打造可逆超分子抗凝剂：创新与突破

Development of supramolecular anticoagulants with on-demand reversibility

今天，咱们来聊一篇刚登载在《Nature Biotechnology》上的前沿研究，题为 “Development of supramolecular anticoagulants with on-demand reversibility”，其通讯作者是瑞士日内瓦大学的 Nicolas Winssinger 教授。这篇论文聚焦于抗凝剂的研发，这类药物在预防和治疗血栓疾病中扮演着关键角色，主要通过抑制关键蛋白酶，像凝血酶（Thrombin）和凝血因子 Xa（FXa），来阻断纤维蛋白生成及血小板活化。然而，当下常用抗凝剂，如肝素、华法林等，存在不少缺陷。以肝素为例，使用期间需频繁监测血药浓度，以防凝血过度，且得依赖鱼精蛋白来逆转其药效。近来，虽说新型抗凝剂如达比加群（凝血酶抑制剂）和利伐沙班（FXa 抑制剂）因无需常规监测的优势被广泛应用，但它们的特异性逆转剂成本高、靶标单一。鉴于此，开发一种高效、可快速逆转的新型抗凝剂迫在眉睫。

为此，Nicolas Winssinger 教授团队提出了一种创新的设计策略，旨在实现抗凝剂的按需可逆性。具体而言，他们将两种能结合凝血酶不同表位的抑制剂，分别与两条互补的肽核酸（PNA）共价相连，借助 PNA 的非共价杂交特性，动态组装形成双价凝血酶抑制剂。其中，一个抑制剂精准靶向凝血酶活性位点，另一个则靶向外位点 II（即肝素结合位点），二者协同作用，显著增强对凝血酶的抑制效果（图 1a）。更巧妙的是，研究团队还设计了互补的 PNA 逆转剂，通过竞争性链置换反应，能够精准解离已形成的抑制剂复合物，从而迅速恢复凝血酶活性（图 1b），这一设计为抗凝治疗提供了前所未有的灵活性和安全性。

图1.具有按需可逆的超分子药物

研究团队受天然抗凝蛋白启发，设计出一种新型双靶点抑制剂。其中，含酮苯并噻唑的活性位点抑制剂（A1）能与凝血酶活性中心结合；而含二氟甲基苯丙氨酸（F2SMP）的外位点 II 抑制剂（E1）则模拟天然磺酸化酪氨酸，通过静电作用与凝血酶外位点 II 的正电区域结合。团队利用固相合成法，分别合成了靶向活性位点的肽段 A（引入酮苯并噻唑修饰，连接 8-mer PNA）和靶向外位点 II 的肽段 E（引入两个 F2SMP 修饰，连接互补的 8-mer PNA）。实验显示，A1 对凝血酶有一定抑制活性（Ki=58.7 nM），而 E1 几乎无抑制活性。然而，当 A1 与 E1 通过 PNA 互补配对组装后，抑制活性显著增强，复合物 A1-E1 的 Ki 值达 74 pM，并且该超分子抑制剂对凝血酶表现出高度选择性。

为探讨片段间超分子相互作用，团队将 PNA 链长从 8-mer 依次缩短至 6-mer、4-mer，发现链长越短，抑制活性越低，但即使是最短的 4-mer 组装复合物（A3-E3），抑制活性仍是单独 A1 的 10 倍，这表明 PNA 介导的超分子相互作用对双靶点协同作用强度有显著影响。

此外，团队在 E1 上用二磺酸苯甲酸酯（DSB）替代 F2Smp 进行修饰，构建了 E4、E5、E6，并与 A1 形成超分子复合物。结果表明，12 号位酪氨酸上用 DSB 取代 F2Smp 可使抑制活性提升两倍（A1-E4），但同时替换两个 F2Smp（E6）则活性下降。磺酸基团的位置和数量对活性也有显著影响。通过丙氨酸扫描 E1 肽序列发现，7 号位异亮氨酸（Ile7）对结合起关键作用，晶体结构显示其在结合时嵌入凝血酶外位点 II 的疏水口袋。进一步将 Ile7 替换为疏水性非天然氨基酸（如叔亮氨酸、正亮氨酸）后，抑制剂活性提升了约 2 倍（A1-E15、A1-E16）。

图2. 抑制剂的优化

接下来，作者选用常用抗凝药物阿加曲班（Argatroban）作为对照，评估 A1-E1 抑制剂在针损伤诱导的局部血栓模型中的体内抗凝效果。实验采用 Alexa 546 标记的纤维蛋白抗体和 DyLight 649 标记的 GP1bβ 抗体，对小鼠外周血进行实时可视化监测。结果显示，A1-E1 与阿加曲班均显著减少纤维蛋白生成和血栓体积（图 3）。与对照组相比，A1-E1 治疗后，损伤部位的纤维蛋白沉积几乎被完全抑制（图 3）。在 5 mg/kg 剂量下，A1-E1 的抗凝效果与阿加曲班相当，但其摩尔浓度仅为阿加曲班的 1/24，表明 A1-E1 在体内环境中依然保持强效抑制活性。

图3. A1-E1与阿加曲班的体内抗凝效果对比

为实现精准调控凝血酶活性的目标，研究团队巧妙地采用二氨基嘌呤（Diaminopurine）替代传统腺嘌呤设计出 PNA 逆转剂。这种创新设计使得含二氨基嘌呤的 PNA 与互补链形成的双链结构相较于含腺嘌呤的更为稳定。同时，团队在超分子抑制剂的一条 PNA 链上引入一段 Toehold 序列（A8-E1），为后续的链置换反应奠定了基础。具体而言，12-mer PNA 逆转剂（AD2）能够高效地与超分子抑制剂发生链置换反应（图 4a,b）。实验结果显示，在 15 nM 超分子抑制剂存在的情况下，加入 10 μM AD2 可在短短 30 分钟内恢复约 40% 的凝血酶活性（图 4c）。进一步研究表明，1 当量的 AD2 在 90 分钟内仅能恢复约 20% 的活性，这明确表明逆转剂对于凝血酶活性的恢复具有显著的剂量依赖性。这些关键发现不仅在荧光底物实时监测反应动力学进程中得到验证，还在纤维蛋白原凝固实验与凝血酶生成分析（CAT）中得到一致证实（图 4d,e；A8-E1+AD2）。基于上述体外实验数据，研究团队进一步评估了 AD2 在体内血栓模型中的实际效果。通过对比纤维蛋白沉积量与血栓体积，发现超分子复合物的抗凝作用能够被有效逆转（图 4f,g）。这些数据有力地证明了超分子抑制剂作为未来治疗药物的巨大潜力，其独特设计框架也为其他疾病的药物开发开辟了全新的思路。

图 4.凝血酶抑制后的活性恢复

本研究运用超分子动态组装策略，成功开发出一款高效且可快速逆转的双价凝血酶抗凝剂，有效解决了传统抗凝剂出血风险高、逆转困难的临床难题，为精准药物设计铺平了道路。