Harnessing eukaryotic retroelement proteins for transgene insertion into human safe-harbor loci
逆转录转座子是 DNA 片段，当其转录为 RNA 时，所编码的酶会将 RNA 复制到基因组的 DNA 中，这一 “自我服务” 的循环使得基因组充斥着逆转录转座子 DNA。人类基因组中约 40% 由这种 “自私” 的 DNA 组成，尽管大部分已失去功能，沦为所谓的垃圾 DNA。最近获批的一种治疗镰状细胞病的 CRISPR-Cas9 疗法表明，基因编辑工具可通过敲除基因出色地治疗遗传性疾病。然而，将整个基因插入人类基因组以替代有缺陷或有害基因依然难以实现。
一种利用来自鸟类的逆转录转座子将基因插入基因组的新技术为基因疗法带来了新希望。该技术可将基因插入人类基因组的 “安全港”，使插入基因不会破坏重要基因，也不会导致癌症。
这种新技术被称为 “精确 RNA 介导的转基因插入（Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes, PRINT）”，它利用某些逆转录转座子在不影响其他基因组功能的情况下，将整个基因有效插入基因组的能力。PRINT 将补充 CRISPR-Cas 技术在敲除基因、制造点突变和插入短 DNA 片段方面的功能。
PRINT 由美国加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授 Kathleen Collins 实验室开发。2024 年 2 月 20 日，相关描述在线发表于《Nature Biotechnology》期刊，论文题为 “Harnessing eukaryotic retroelement proteins for transgene insertion into human safe-harbor loci”。
PRINT 技术采用与 CRISPR-Cas9 基因组编辑递送方法相类似的手段，将新 DNA 插入细胞。在 PRINT 过程中，递送的 RNA 包括几个关键组分：其一，编码一种常见的逆转录因子 ——R2 蛋白的 RNA，该蛋白包含多个活性区域，既含有能结合并切割双链 DNA 的缺口酶，也含有能以 DNA 为模板生成 RNA 的逆转录酶；其二，作为插入转基因 DNA 模板的 RNA；其三，基因表达调控元件，它们共同构成 R2 蛋白插入基因组的完整自主转基因盒。
运用 R2 蛋白的关键优势之一，在于它能够将转基因精准插入基因组中核糖体 RNA 基因集中的区域，这些区域包含数百个相同基因副本，每个副本都负责编码核糖体 RNA—— 这种 RNA 能将信使 RNA（mRNA）转化成蛋白质。由于存在大量的冗余副本，即便插入的基因破坏了个别核糖体 RNA 基因，也不会产生不良后果。
将转基因置于安全港可有效规避使用病毒载体插入转基因时常见的风险：随机插入基因组可能使正常工作基因失效，扰乱基因调控或功能，甚至引发癌症。
Collins 指出：“CRISPR-Cas9 技术可用于修复单个突变核苷酸或插入小段 DNA 序列，也可通过位点特异性诱变来敲除基因功能。而我们采用的是一种互补策略，即在基因组中添加一个能够自主表达、产生活性蛋白的基因，以此作为缺失旁路，重新引入功能基因。这是一种转基因补充手段，而非逆转基因突变。对于修复因同一基因多个单突变导致功能缺失的疾病，这种方法非常有效。”
许多遗传性疾病，例如囊性纤维化和血友病，皆由同一基因的多种不同突变引发，最终致使基因功能丧失。基于 CRISPR-Cas9 的基因编辑疗法必须针对患者特定突变量身定制，而 PRINT 技术进行基因补充时，可将正确基因传递给患者，使其身体能够产生正常蛋白，不受原始基因突变类型限制。
当前，众多学术实验室及初创公司正致力于利用转座子和逆转座子进行基因治疗的研究。生物技术公司广泛研究的一种逆转座子是 LINE-1（长散布元件 - 1），它不仅能在人类基因组中自我复制，还能携带一些搭车基因，占据约 30% 的基因组。尽管目前人类基因组中仅有不到 100 个 LINE-1 逆转座子副本具备功能，占比极小。
Collins 与加州大学伯克利分校博士后研究员 Akanksha Thawani 以及该校分子与细胞生物学系教授 Eva Nogales 于 2023 年 12 月 14 日在《Nature》期刊上发表了 LINE-1 编码的酶蛋白的冷冻电镜结构研究成果（Nature, 2023, doi:10.1038/s41586-023-06933-5）。
Collins 指出，新研究明确显示，LINE-1 逆转录转座子蛋白较难安全有效地将转基因插入人类基因组。但此前研究发现，插入重复核糖体 RNA 编码区（rDNA）的基因可正常表达，这让她联想到 R2 逆转录因子，认为它或许是更安全的转基因插入工具。
鉴于 R2 在人类中不存在，Collins 团队联合加州大学伯克利分校高级研究员 Zhang 和博士后研究员 Van Treeck，从昆虫、马蹄蟹等多细胞真核生物的数十种动物基因组中筛选 R2，最终锁定对人类 rDNA 区域高度靶向且能高效插入长 DNA 的版本。
Collins 透露：“在筛选几十种物种后，鸟类基因组中的 R2 表现最为出色，包括斑马雀和白喉麻雀等。尽管哺乳动物基因组不含 R2，却存在 R2 有效插入所需的结合位点，这可能意味着哺乳动物祖先曾有类似 R2 的逆转录因子，后来不知何故丢失。”
实验中，Zhang 和 Van Treeck 合成了编码 R2 蛋白的 mRNA 和携带荧光蛋白的转基因模板 RNA，并将其共转染至体外培养的人类细胞。在激光照射下，约半数细胞因荧光蛋白表达而发出绿色或红色光，表明 R2 成功将转基因插入基因组。
后续研究表明，转基因确实插入 rDNA 区域，且每 10 份 RNA 模板插入其中，不会破坏 rDNA 基因的蛋白制造活性。
rDNA 区域的独特优势
将转基因插入 rDNA 区域，除提供安全港外，还具有其他优势。rDNA 位于五条独立染色体短臂，共同构成核仁结构。在核仁内，rDNA 转录受高度调控，基因损伤会迅速修复，因 rDNA 损伤可能导致蛋白生产停滞。因此，在核仁内，转基因将受到严密保护。
Collins 表示：“核仁是核糖体生物发生的中心，也是优越的 DNA 修复环境，基因插入的致癌风险很低。此区域多拷贝、保守，是基因疗法的理想插入位点。”
尽管 R2 的工作机制和 rDNA 转录的生物学问题仍存在未知，如多少 rDNA 基因会先被打乱？部分细胞会关闭 400 多个 rDNA 基因中的许多基因，这些细胞是否更易受 PRINT 副作用影响？Collins 团队正在探究这些问题，并优化逆转录因子插入相关的蛋白和 RNA，以提升 PRINT 在体外细胞和原代细胞中的性能。Collins 强调：“R2 系统已证明有效，但要充分利用 rDNA，还需深入研究其生物学特性。”
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Anti-HIF-1 alpha antibody [H1alpha67] | ab1-100ug | 100ug |
| Anti-Tubulin antibody [DM1A +DM1B] - Loading Control | ab44928-500ul | 500ul |
| GenePrint® 10 System | B9510 | 50 reactions |
| QIAamp 96 Viral RNA Kit (10) | 52962 | 10T |
危险品化学品经营许可证(不带存储) 许可证编号：沪(杨)应急管危经许[2022]202944(QY) 
营业执照(三证合一)