一．免疫组织/细胞化学简介

免疫组织化学（IHC）是确定组织切片上蛋白的存在与否及存在位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或ELISA等免疫测定方法低，但是它能观察到整个组织的情况，同时可以检测目的蛋白在组织中的表达位置。适用于评估癌症等疾病的发展及治疗情况。因此，从IHC获得的信息结合显微技术给广大科研工作者提供了一幅“宏图”，使来自其它方法的数据有据可依。

免疫细胞化学（ICC）技术则是IHC技术在细胞样本中的应用，通过对悬浮/爬片细胞进行免疫染色，可以检测到目标蛋白在细胞中的表达位置和含量等信息，更加直观。

IHC和ICC染色是抗体识别靶抗原的过程。因为抗体与抗原的结合是高度特异的，因此，它只与组织切片或细胞样本中相应的蛋白结合。应用显色检测法即能看到抗原—抗体反应，其显色方法是将使用酶结合的抗体，在添加底物后，通过酶促反应在蛋白位点产生色素沉着。另外一种方法是直接使用荧光染料标记的抗体，将抗体识别与荧光显色技术相结合，通过荧光显微技术对样本进行检测，这种方法通常被叫做免疫荧光（IF）。结合目前先进的荧光显微镜成像技术，如激光共聚焦显微镜，IF可以得到检测样本的三维立体结构，更加形象直观。

要实现可靠一致的实验结果，对操作流程的优化必不可少。IHC/ICC/IF的原理和实验步骤大体相同，整体实验流程如下图所示。

免疫染色实验流程图

二．设计实验  

1.实验对照

实验对照：在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，因此对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。常用的对照组有以下几种：

阳性对照：用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。所以若预期染色结果是阴性时，就必须设阳性对照。

阴性对照：用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对照可证实组织内若不含靶抗原，就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。

空白对照：是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色。

替代对照：用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。但使用的商品抗体往往不能用同一种动物的免疫前血清做替代对照，也可用未经免疫的同种动物血清，即非免疫血清替代一抗。

吸收试验对照：用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。

自身对照：用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。现代国际上发表文章，一般在免疫组化染色的同时，还须有Western blotting做相应蛋白质检测的实验结果加以证实。

2.预实验

好的开始是成功的一半，在实验中尤其如此。一个好的实验设计往往决定了实验的成败。在正式试验开始前，最好设立一项小规模的预实验，可以确定某个抗体（尤其是新抗体）的最佳使用条件。可以借助此小型预实验，解决操作流程中关键步骤的潜在问题，然后再开展规模较大的实验，这样不仅节省时间，还能减少试剂消耗。

3.显色方式和抗体的选择

一抗是免疫学实验的关键成分，其性能可直接影响到数据量。能用于免疫印迹法（WB）检测特异性条带的抗体无法充分保证适用于IHC/ICC/IF等实验。这是因为WB分析将蛋白置于容易导致还原/变性的恶劣条件中，使蛋白结构发生变化（失去3D结构，变为线性形式）。经验证可用于WB的抗体识别表位，在IHC/ICC/IF实验中，因为蛋白维持其天然状态，则可能会被隐藏和/或被掩盖。