IP/Co-IP实验结果分析

一个成功的 Co-IP 实验，基于合理正确的实验结果，这不仅包含了蛋白质之间相互作用的结果检测，还要有全面合理的对照组。包括证明靶蛋白 X 和预测的相互作用的蛋白 Y，是否存在于蛋白质样品中的Input对照组，以及排除免疫球蛋白IgG本身亲和作用的对照组等。

我们一般常见最基本的Co-IP结果如上图，即验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用。分析该实验结果，被分为两组，即Input组和IP组。Input组表示蛋白X、Y在样品中是表达的，并且可以通过WB检测。IP组中IgG即为阴性对照，利用非相关的IgG进行沉淀实验，蛋白X与蛋白Y不会被IgG的非特异性亲和作用沉淀下来，用于排除蛋白与IgG的非特异性结合造成的假阳性结果。而IP组中Anti-Protein X组，是利用蛋白X的抗体进行沉淀实验，结果蛋白X被沉淀下来，蛋白Y也被沉淀下来，由此得到结论蛋白X与蛋白Y之间存在相互作用。

当目的蛋白在样本中表达含量较低，或没有合适的IP抗体时，我们可以考虑使用转染外源过表达质粒，来表达对应的带有标签的融合蛋白。以下图文献中的实验结果为例，验证带有FLAG标签的EDR1蛋白和带有GFP标签的EDR4蛋白之间的相互作用。实验被分为两组，第一组是过表达GFP标签蛋白及EDR1-FLAG蛋白，第二组则过表达了EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白。

Input：两组Input的WB结果显示，在目的细胞中，融合蛋白过表达成功，样本中有较为丰富的目的蛋白过表达。    

IP：利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀，图上显示两组实验在130kd都存在蛋白，说明两组实验的EDR1-FLAG均可被沉淀下来。

Co-IP：进一步检测GFP，图上显示第一组实验没有条带，而第二组实验在130kd处有蛋白。说明EDR1-FLAG可以通过相互作用，把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来，而不能与GFP标签相互作用，因此证明，EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用。

（文献来源：ENHANCED DISEASE RESISTANCE4 Associates with CLATHRIN HEAVY CHAIN2 and Modulates Plant Immunity by Regulating Relocation of EDR1 in Arabidopsis. Guangheng Wu, et, al. Plant Cell, 2015, 27(3): 857-873）