手把手课程之IHC/ICC关键操作步骤，本期品牌：R&D Systems

首发微信公众平台：优宁维抗体专家 

本文重点介绍免疫组织化学（IHC）或免疫细胞化学（ICC）实验中的关键优化步骤，文中所提供的数据和优化建议均来自R&D Systems的IHC/ICC技术团队。

— 以下为R&D Systems产品做IHC/ICC的检测实例 — 

IHC和ICC的荧光检测实例：

A. 用抗人VSIG1亲和纯化多克隆抗体（AF4818）对人睾丸冰冻切片中的VSIG1进行荧光IHC检测。

使用NorthernLights-557标记的抗绵羊IgG二抗（货号NL010红色）染色组织并用DAPI（蓝色）复染。

B. 用抗人GFAP亲和纯化多克隆抗体（货号AF2594）对胶质纤维酸性蛋白进行荧光检测，以测定在大鼠皮质干细胞分化培养物中的表达。用NorthernLights-557标记的抗绵羊二抗（货号NL010；红色）染色细胞并用DAPI（蓝色）复染。

IHC和ICC的显色检测实例：

A. 用抗人IRF8亲和纯化多克隆抗体（货号AF5117）对石蜡包埋的人淋巴瘤组织切片中的干扰素调节性转录因子8（IRF8）进行显色检测。

用anti-sheep HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit（货号CTS019；褐色）染色组织并用苏木精（蓝色）复染。

B. 用calcium ionomycin (0.5mg/ml) 和PMA (50ng/ml ) 刺激人外周血单个核细胞并用抗人IFN-γ亲和纯化多克隆抗体（货号AF285）对IFN-γ的表达进行显色检测。用anti-goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit （货号CTS0008；褐色）染色。

— 接下来从几个关键步骤中总结成功的IHC/ICC实验需要注意的优化环节 —

【样品准备】

组织切片须切成超薄切片（5-10µm）或小块用于whole mount IHC；ICC在染色之前须将细胞吸附在玻片上。

样品准备的方法取决于固定方法，固定方法受所要使用的检测技术的影响（荧光或显色）。如：用甲醛浸润固定的组织须经石蜡包埋并用显微切片机切成薄片；检测磷酸化依赖型的表位，需将组织速冻并在低温恒温器中进行切片，后醇固定。

IHC组织样品准备比较：

【固定】

固定会改变组织的化学组成，在保护组织结构和维持抗原表位之间需权衡。固定不充分，蛋白在组织中会快速降解，影响特异性免疫反应；过度固定，会遮蔽抗原表位或导致很强的非特异性的背景染色。

甲醛是最常用的固定剂，甲醛的过度固定会改变抗原表位中的氨基酸并组织抗体的结合。一般可使用抗原修复试剂进行抗原表位修复并恢复和抗体的结合。但甲醛会导致磷酸依赖型的表位从膜转移到胞质溶胶中，此种情况可使用冰冷的无水甲醇或无水乙醇。

固定最常用的醇类是甲醇和乙醇，通常认为醇对组织形态的保护不如甲醛类固定剂。醇的穿透能力不如甲醛，主要用于固定冰冻组织切片和细胞。醇固定更适合于细胞膜表面抗原，固定后不建议进行抗原修复。

丙酮是强脱水剂，会引起组织蛋白的不可逆沉淀，常用于未固定的速冻组织，丙酮处理之后再用醇或甲醛固定。

【防止非特异性染色】

引起非特异性结合的因素包括一抗和二抗与血清蛋白间的相互作用、抗体和组织间的离子相互作用以及抗体和能影响到所用的IHC检测体系的内源性分子之间的相互作用。

1.防止非特异性疏水相互作用

由于一些氨基酸具有中性侧链，大多数蛋白质都有某种程度的疏水性。用热灭活的正常血清/BSA与组织孵育是常见的降低非特异性疏水结合的方法。

正常血清类型应选择与二抗来源种属相同或不相关种属的，如山羊血清不适合作为山羊来源的一抗的封闭剂。非离子去污剂如0.3%Triton X-100^TM或Tween 20^TM也可以降低非特异性疏水相互作用。

血清可以有效封闭非特异性结合：

A. 用生物素标记的抗人CD14亲和纯化多克隆抗体（货号BAF383）检测石蜡包埋的人扁桃体组织中的CD14。使用碱性抗原修复试剂盒（货号CTS013）修复组织抗原。用HRP标记的高灵敏度链霉亲和素（HSS-HRP）和DAB染色并用苏木精复染（蓝色）。

B. 在平行实验中，与一抗孵育之前用动物血清室温下封闭15min显著降低了非特异性背景染色。R&D Systems的所有细胞和组织染色试剂盒中都含有HSS-HRP和动物封闭血清。

2. 防止非特异离子相互作用

如果使用的抗体和靶组织带有相反的静电荷，离子相互作用就会引起非特异性背景染色，增加固定剂和/或抗体稀释缓冲液的离子强度可以减少离子相互作用。但是表位-抗体的结合也依赖离子力，这种方法也有可能降低染色的特异性。相比多克隆抗体，单克隆抗体更容易受到离子强度降低的影响。

3. 内源性酶的干扰

显色检测方法常使用偶联的酶使表位-抗体的相互作用显现出来，此时就需要封闭内源性的酶活性。

肾、肝或含有血管（包含红细胞）的组织等都有内源性的过氧化物酶活性。用3-10%H2O2配制的过氧化物封闭试剂可以用来防止内源性过氧化物酶剪切底物。

肠、肾、淋巴和其他组织中的AP酶可以用1mM的Levamisole封闭。肠形式的AP不受Levamisole的影响但是可以用1%的醋酸封闭。

H₂O₂处理可以清除内源性过氧化物酶活性：

 A. 在染色前未清除内源性过氧化物酶活性的人类肾组织切片呈现出假阳性信号。组织染色用的是anti-goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining kit (货号CTS008；褐色)。

B. 同一组织在染色前于室温下用3%H2O2的甲醇溶液处理15min，去除内源性过氧化物酶活性。

4. 内源性生物素的干扰

IHC/ICC常用检测系统是利用链霉亲和素与生物素标记的一抗和二抗的结合，因此，在链霉亲和素孵育之前必须先封闭内源性生物素。

【一抗孵育起始条件】

【荧光检测】

R&D Systems的NorthernLights荧光色素有着不重叠的光谱性质,非常适合多色IHC和ICC： 

A. NorthernLights-493 anti-goat IgG (货号NL003; 绿色)和NorthernLights-557 anti-mouse IgG(货号NL007; 红色)的发射曲线。

B. 利用anti-rat Nestin 亲和纯化的多克隆抗体（货号AF2736; 绿色）和anti-neuron specific beta-Ⅲ Tubulin单克隆抗体（克隆号 TuJ-1）（货号MAB1195; 红色）多色检测大鼠皮层干细胞中的Nestin和beta-Ⅲ Tubulin。细胞经过NorthernLights-493 (货号NL003; 绿色)和NorthernLights-557 anti-mouse IgG(货号NL007; 红色)二抗染色，并经DAPI（蓝色）复染。

【抗原修复】

抗原修复方法通常分为两大类：蛋白酶诱导的表位修复（PIER）和热诱导的表位修复（HIER）。

1. 蛋白酶诱导的表位修复（PIER）

在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢复抗体与表位的结合。PIER的缺点在于恢复免疫反应性的成功率低，且有可能破坏组织形态和目的抗原。

2. 热诱导的表位修复（HIER）

HIER对时间、温度、缓冲液和pH特别敏感，最佳方法必须是根据经验确定。R&D Systems提供了一些试剂，可改善组织抗原检测，并增强免疫反应性。

在初次优化时，研究人员可比较经中性pH7.0通用抗体修复液（货号CTS015）处理的样品和未经过抗原修复的同一组织样品，之后可能需要使用酸性或碱性的抗原修复液，这取决于组织。

在R&D Systems，我们发现碱性抗原修复液（货号CTS013）的处理通常很成功。我们也提供酸性（货号CTS014）以及试用装（CTS016）的抗原修复液。与中性溶液相比，酸性和碱性抗原修复液更可能影响组织形态。

抗原修复改善了p27的检测：石蜡包埋的人前列腺癌切片在指定的抗原修复液中以95℃孵育10min后，IHC图像显示了p27的检测。与无HIER处理相比，中性（pH7.0）和碱性（pH9.5， 货号CTS013）抗原修复液的孵育都增强了p27的检测，但酸性（pH5.0， 货号CTS014）抗原修复液没有效果。p27是利用anti-human/mouse/rat p27单克隆抗体（货号MAB22561; 棕色）检测的。

【细胞和组织染色试剂盒和试剂】

1. 细胞和组织染色试剂盒

2. 细胞和组织染色试剂

上海优宁维生物科技股份有限公司

抗体专家 | 流式专家 | 免疫组化专家 | 实验服务专家 | 科学仪器

免费热线：4008-168-068    咨询邮箱：info@univ-bio.com   微信平台：优宁维抗体专家