pBM27 Toposmart快速克隆试剂盒

品牌： Absin

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产品信息

商品描述

利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM27载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM27载体类似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入门载体，具有attL1和attL2，为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。
产品特点：
1、连接反应仅需5分钟；
2、只适合平末端PCR产物的快速、高效、定向克隆；
3、载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选；
4、可在基因的C端中融合Flag标签序列；
5、载体为壮观霉素抗性。
产品信息：

组分	20T	20T ×3
pBM27 Vector (20ng/ul )	20 ul	20 ul×3
10×Toposmart	20 ul	20 ul×3
Control Insert EGFP	5 ul	5 ul
M13F(-21) Primer(使用前加入60ul ddH2O)	0.1OD	0.1OD×3
M13R Primer(使用前加入60ul ddH2O)	0.1OD	0.1OD×3

应用

注意事项

1、引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引物的5’端添加CACC四个碱基（CACC为真核表达所必需的Kozak序列）。如果目的蛋白需要在C端带FLAG标签，下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子（3个碱基），目的蛋白的翻译终止由FLAG标签的终止密码子TAA（位于Xho I酶切位点前）来实现。
2、DNA聚合酶：选用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD和Xerox 等高保真DNA聚合酶用于PCR扩增。
3、连接时间：5-15分钟，一般为15分钟。
4、连接温度：室温 (22℃-37℃)，可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构，可在37℃反应。
5、产物要求：为保证PCR产物完整，建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度，如PCR产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带，无引物二聚体，可以取1-3ml的PCR产物直接连接。
但若扩增模板为质粒DNA，应注意质粒的抗性。由于pBM27载体为壮观霉素抗性，以壮观霉素抗性的模板质粒扩增的PCR产物应切胶回收后再连接。
6、片段用量：胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。
7、往M13F(-21)和M13R引物干粉管加120ml灭菌水即为5mM浓度的引物。

制备和贮存

保存方式

-20℃保存，有效期12个月。

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货号：

abs60096-20T×3

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