人多功能干细胞（PSC） 诱导神经干培养基

本品是一种无血清培养基。PSC 补充液含诱导神经干细胞命运的小分子化合物和细胞因子，与 PSC 培养基搭配使用，可实现7天内由人多能干细胞(PSCs) 高效诱导为人神经干细胞(NSCs)。与现有的方法不同，使用PSC神经诱导培养基不需要胚状体(EB)形成的中间步骤，因此节省了时间和劳力。
产品组成：

名称	规格	保存方法	有效期
人多功能干细胞（PSC） 神经诱导培养基	480mL	2℃~8℃，避光	18个月
PSC 补充剂	20mL	-20℃，避光	12个月

培养条件 
培养基：PSC 完全培养基 
培养类型：贴壁 
推荐底物：Vitronectin 或Geltrex®LDEV-Free hESC -合格的降低生长因子基底膜基质 
温度范围：36°C至38°C 
培养大气：5% CO₂的湿润环境。确保在培养容器内实现适当的气体交换。
程序指南
1、将冷冻的PSC 补充液在2°C至8°C下解冻过夜，或在37°C水浴中快速解冻约5分钟。 
2、解冻后的补充液可分装成多个相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制备较小体积的完整培养基。不要重新冷冻解冻。
培养基准备 
1、将小瓶轻轻倒置几次，混合解冻后的补充液。 
2、从瓶中取出20mL PSC补充液，转移到PSC培养基瓶中。旋转瓶子混合，即得 500mL完全培养基。
3、PSC 完全培养基可在2°C至8°C保存2周。使用前，在37°C 水浴中预热当天所需量的完整培养基5-10分钟。
PSC细胞准备 
1、在无饲养细胞条件下培养的高质量人PSC(具有最小或无分化菌落)。注：在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的人PSCs也可用于神经诱导。 
2、在6孔板上涂上适当的底物，用于培养PSC。 
3、当PSCs达到70-80%的融合度时，去除任何分化和部分分化的克隆。 
4、按照PSC培养方案从培养板中取出PSC，并按以下方法估计悬浮中的PSC团块中的细胞浓度：a. 将一部分细胞悬液转移到15mL的离心管中(例如，从6孔板的一孔制备1mL的6mL PSC悬浮液)，以估计PSC细胞悬浮液的总细胞数。b. 取15 mL离心管与细胞在200×g下离心3分钟，弃去上清。c. 将1mL预热好的细胞解离试剂加入15mL离心管中，37℃孵育5 分钟。d. 用1mL移液管上下用力移液5次，使细胞分离成单个细胞悬液。e. 使用您喜欢的方法确定总单元格数。若1 mL 细胞解离试剂中细胞总数为1×10 ⁶，则剩余5 mL PSC悬液中细胞总数为：(1×10 ⁶ )×5 =5×10 ⁶。 
5、从新的包被的6孔板(步骤2)中抽吸包被液，并在每孔中加入2.5 mL PSC培养基。 
6、轻轻摇动含有PSC细胞悬液的离心管，将PSC以每孔2.5×10 ⁵ - 3×10 ⁵的细胞数量加入包被的6孔板中。例如，如果PSC 悬液中的细胞浓度为1×10 ⁶个细胞/mL，则在每孔中加入0.25-0.3 mL的PSC悬液。 
7、快速前后左右移动培养皿，使细胞分散在培养皿表面，并将其轻轻置于37°C、5% CO₂的培养箱中。
注意：传代PSCs 时，细胞应以小团块的形式接种，而不是单个细胞悬液。避免将PSCs作为单个细胞进行接种，因为这会导致细胞死亡增加。 
注意：您可以在分裂时将10 μM ROCK抑制剂Y27632加入PSC培养基中过夜，以防止细胞死亡。
神经诱导 
1、预热PSC 完全培养基至室温。 
2、在神经诱导的第0天(PSC传代后约24小时)，PSC应达到15-25%的融合度。抽吸废培养基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL预热好的PSC 完全培养基。将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中。 
3、在神经诱导的第2天，细胞集落的形态应该是一致的。标记所有非神经分化克隆，如果有的话，用巴斯德玻璃移液管或移液管尖端去除这些不需要的克隆。抽吸废培养基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL预热好的PSC完全培养基。将培养皿放回培养箱。 
4、在神经诱导的第4天，细胞将达到融合。任何非神经分化的克隆都应标记并移除。从每孔中抽吸废培养基，每孔用5ml 预热的PSC完全培养基代替。将培养皿放回培养箱。 
5、在神经诱导的第6天，细胞应接近最大融合。去除任何非神经分化克隆，在每个孔中加入5mL预热的PSC完全培养基。将培养皿放回培养箱。注：在神经诱导的第4 ~ 7天，如果细胞的颜色变为褐色， 并且有许多漂浮细胞，说明PSCs的起始密度过高。在这种情况下，每天更换培养基，每孔加5mL PSC 完全培养基。 
6、在神经诱导的第7天，NSCs (P0)已经准备好收获和扩增。扩增可参考有关NSC扩增、NSC冻存、NSCs复苏和NSC特性的详细说明。