Random Mutagenesis Kit

随机突变是阐述蛋白质结构和功能之间的关系 、改进蛋白质性能的重要工具 。StarMut 随机突变试剂盒基于易错 PCR （error-prone PCR）技术，利用 Taq DNA polymerase 不具有 3 ′→5 ′校对功能的特性，在特定的反应缓冲体系中，向扩 增的目的基因中引入随机突变密码子。带有随机突变的扩增产物通过双酶切，连接到表达载体中构建文库，然后转化入表达 宿主中，进行蛋白活性筛选。如果经一次突变反应不能获得满意的结果，可采用连续易错 PCR（ sequential error-prone PCR）策略，即将一次 PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获 得的突变累积而产生更有意义的突变 。本试剂盒包含有优化的 2xStarMut Random System 、StarMut Enhancer 和 Sterile Water 三种组分，使用时只需加入适量的 DNA 模板和合成的两条扩增引物，并用水补足体积，即可进行扩增反应， 操作简便快速，大大减少了多次加样可能造成的出错和污染机会。2xStarMut Random System 含有优化浓度的 Taq DNA polymerase 、dNTPs 、反应缓冲液和稳定剂，可最大限度地克服常规易错 PCR 技术中，由于 Taq DNA polymerase 本身 的偏爱性造成的以 GC 突变为主的缺点，获得相对均衡的突变谱。碱基突变率可通过适量添加 StarMut Enhancer 、调整模 板 DNA 量和改变 PCR 扩增循环数进行控制。
下表列出以 10 ng 质粒 DNA 为模板，PCR 扩增一条 1 kb DNA 片段（20 个循环）后测序检测得到的突变率结果。需要注 意的是，由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的 PCR 反应 条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据实验的具体要求，首先进行多个小体系（20 ul）扩 增预实验，分别加入不同体积的 StarMut Enhancer（如 0 ul 、1ul 、5 ul 、10 ul 等），摸索出符合目标突变率的反应条件 后，再放大扩增体系。其他影响突变率的因素见【注意事项】。
以50 µl PCR反应体系为例：

反应条件	1	2	3	4	5	6
StarMut Enhancer (ul）	0	1	2.5	5	10	20
突变碱基的个数/1 kb	0~1	0~3	0~4	1~6	3~10	5~18
平均突变碱基数/1 kb	0.3	1.6	2.3	4.1	6.5	10.2

本试剂盒适用于扩增低于 4 kb 、GC 含量在 70%以下的目标 DNA 片段。

【产品组分】

组分货号	组分名称	T115-01
ZT115-101	2xStarMut Random PCR Mix	500 ul
ZT115-102	StarMut Enhancer	400 ul
ZA129-101	Sterile Water	1 ml

1、由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的 PCR 反应条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据具体实验要求，首先进行多个小体系（20 ul）扩增预实验，分别加入不同体积的 StarMut Enhancer（如 0 ul、1 ul、5 ul、10 ul 等），通过测序或活性检测等方法，摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。
2、起始 DNA 模板的浓度对突变率有很大影响，通常可通过提高或降低 DNA 模板的浓度来调整突变率。鉴于不同型号的分光光 度计检测的 DNA 浓度存在偏差，DNA 模板最好在酶切线性化后，采用凝胶电泳方法，与已知浓度的线性化双链 DNA 或商品化的 DNA marker 进行对比，确定其浓度。
3、突变反应产物必须进行切胶回收处理，去除 DNA 模板、PCR 产物上结合的 Taq 酶以及其他杂质。常规的乙醇沉淀、硅胶膜 （珠）或玻璃奶吸附等方法，均无法去除结合的 Taq 酶，后者可能遮蔽酶切位点，影响克隆效率。
4、建立随机突变文库通常需要 10-200 ng/ul （相当于 500 ng -10 ug/50 ul 体系）的 PCR 产物。如遇产量不足，可通过下列方法提高产量：
（1）突变率符合需求时，可放大 PCR 体系，或切胶回收 PCR 产物后，采用常规 PCR 反应条件进行扩增；
（2）突变率低于需求时，提高 PCR 扩增循环数，或切胶回收 PCR 产物后，进行第二轮随机突变反应；
（3）重新设计扩增引物;
（4）降低退火温度；
（5）确保模板质量，采用凝胶电泳方法精确定量。
5、对于带有克隆酶切位点的 DNA 模板，必须在 PCR 反应结束后，使用 DpnI 完全消化清除甲基化的模板，再切胶回收目标 DNA 片段。对于非甲基化的质粒（例如从大肠杆菌 JM110 或 SCS110 菌株中提取的质粒），可通过转化 dam＋ 的大肠杆菌菌株（如 DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等），再抽提获得甲基化的质粒作为 PCR 反应模板。
6、经过双酶切的克隆载体在插入突变DNA片段前，应首先通过自身连接检测，确保极低的自连背景。必要时可采用去磷酸化、 切胶回收等方法把自连率降至最低，以免影响后续连接反应。