两篇CELL带您get氧化应激新思路

氧化应激(OS)是指机体在需要清除体内老化的细胞，或在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子，如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。
为了适应高活性氧水平，肿瘤细胞会改变硫基代谢、NADPH生成和抗氧化转录因子的活性。在启动过程中，遗传变化通过激活抗氧化转录因子或通过戊糖磷酸途径（PPP）增加NADPH，使细胞在高ROS水平下存活。在肿瘤的进展和转移过程中，肿瘤细胞通过各种方式增加NADPH来适应氧化应激，包括激活AMPK、PPP、以及减少谷氨酰胺和叶酸代谢。
 

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氧化应激相关领域的研究一直是基础研究的热点。尤其是近20年来，关于该领域研究的文章更是呈线性增长。精细研读高分文章，了解研究思路成了很多老师的入门必修课。今天小优就带大家深入学习两篇氧化应激的高水平文章!

 

2001年-2020年PubMed 氧化应激相关文献数

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1. CELL: 抗氧化剂通过稳定BACH1水平来刺激肺癌转移
瑞典卡罗林斯卡学院和哥德堡大学Martin Bergo教授团队
 

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最初，ROS被认为能促进肿瘤进展和转移，这促使健康人群和肿瘤患者在饮食中添加抗氧化剂。然而近年来，新的证据显示，ROS具有抗肿瘤作用，因此，外源/内源抗氧化剂（Antioxidant）具有促肿瘤作用。抗氧化剂可以保护原发性肿瘤细胞免受ROS和DNA损伤，否则它们会激活p53并减慢肿瘤细胞增殖。此外，通过激活NRF2突变或失活KEAP1突变来刺激内源性抗氧化剂基因的转录，可以增加原发性肺肿瘤的生长。
与NRF2一样，BACH1（BTB and CNC homology 1）可响应氧化还原状态的变化而与抗氧化反应元件（ARE）结合。在氧化应激条件下，含血红素的蛋白质氧化释放出游离血红素，从而刺激BACH1；在低氧化应激条件下，血红素水平较低，从而稳定BACH1。本文章研究表明长期补充抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和维生素E会促进KRAS驱动的肺癌转移。抗氧化剂通过降低游离血红素的水平并稳定转录因子BACH1来刺激转移。 BACH1激活Hexokinase 2和Gapdh的转录，并增加葡萄糖摄取，糖酵解速率和乳酸分泌，从而刺激小鼠和人类肺癌细胞的糖酵解依赖性转移。靶向BACH1可正常化糖酵解并防止抗氧化剂诱导的转移，同时在缺乏抗氧化剂的情况下，增加内源性BACH1的表达可刺激糖酵解并促进转移。我们得出结论，BACH1刺激糖酵解依赖性肺癌转移，并且BACH1在降低的氧化应激条件下被激活。
（与该篇文章背靠背同时在Cell发出的还有M. Celeste Simon et al. BACH1 Orchestrates Lung Cancer Metastasis. Cell, online 27 June 2019, DOI: 10.1016/j.cell.2019.06.020，共同揭示肺癌转移中的氧化应激新机制。）
 

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本文重点：
1. 抗氧化剂刺激KRAS驱动的肺癌转移
2. 抗氧化剂降低血红素水平并稳定BACH1
3. BACH1激活Hk2和Gapdh转录触发糖酵解诱导的转移
4. 靶向BACH1或其糖酵解靶标可防止抗氧化剂诱导的转移
总结：抗氧化剂通过降低游离血红素水平和稳定转录因子BACH1来刺激肺癌转移

话不多说，咱们开始分析结图（图很多，信息很广，大概需要花30-60min阅读完，虽然篇幅比较长，但确实是花了小编很长时间和精力提炼出来的干货，请耐心看完哟！）

1. 抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和维他命E可独立于p53基因促进肺癌转移；慢性抗氧化作用增加肺癌细胞的侵袭力，减少活性氧，增加减少能量。
    
   

   图1: 抗氧化剂NAC和维他命E可独立于p53基因促进肺癌转移

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   （A）给予Kras2LSL / +（K）和Kras2LSL / + Trp53fl / fl（KP）小鼠吸入低剂量的Cre-腺病毒。一周后，在饮用水中服用NAC（1 g / L），在食物中服用维生素E（VitE，0.5 g / kg）。
   （B）具有淋巴结转移的K小鼠的百分比。
   （C）前表面活性剂蛋白C（pro-SPC）的IHC图：对照K小鼠的正常淋巴结（上）、NAC处理的K小鼠的放大的转移淋巴结（下）。
   （D）左图，尸检时，K小鼠具有远处转移的百分比。右图，肾脏（上）和肝脏（下）的远处转移照片。
   （E）具有淋巴结转移的KP小鼠的百分比。
   （F）左图为具有胸腔转移的KP小鼠的百分比。右图，胸肋骨转移的照片。
   （G）在吸入Cre-腺病毒58周后，从对照（mTC）和NAC处理（mTN）K小鼠建立了肺肿瘤细胞系。除非另有说明，否则都在无抗氧化剂的条件下培养细胞。
   （H）使用xCelligence系统分析实时细胞入侵。曲线显示3 mTC和4 mTN细胞系的平均侵袭指数。
   （I）mTC和mTN细胞的Transwell入侵实验。
   （J）左图，静脉内注射mTC和mTN细胞（0.5×105个细胞/小鼠；n = 10）3周后，同基因小鼠肺转移。红点表示小鼠转移至肺以外的器官。右图，有代表性的肺切片染色。
   （K）左图，皮下注射移植mTC和mTN细胞3周后出现淋巴结转移的NSG小鼠百分比（2.5×105个细胞/小鼠；n = 6）。右图，移植后3周后的肿瘤重量。

2. 抗氧化剂通过降低活性氧和游离血红素来稳定BACH1水平。
 

图2: 抗氧化剂通过降低游离血红素水平来稳定BACH1水平

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（A）RNA-seq数据的维恩图显示了在mTN（抗氧化剂组）与mTC（对照组）细胞（蓝色）中差异表达的基因数量。小圆圈显示在其近端启动子中具有NRF2和BACH1结合基序的基因。
（B）对mTC和mTN细胞（n = 3）中BACH1和NRF2靶基因进行实时qPCR分析。首先将数据标准化为Rplp0表达，然后再标准化为mTC，取两次实验的平均值。
（C）TCGA数据的Kaplan-Meier图显示了高和低BACH1表达（Z评分= 2）的肺腺癌（LUAD）患者的生存率。
（D）ROS和血红素诱导的BACH1降解的示意图。
（E）左图，western blot显示了mTC和mTN细胞系（n = 3）中BACH1的稳态含量。右图，两次实验的BACH1蛋白条带的灰度值定量。ACTIN是内参。
（F）左图，western blot显示了用NAC或Trolox孵育mTC细胞（> 7天）后BACH1的变化。右图，三次实验BACH1蛋白条带的灰度值定量。ACTIN是内参。
（G）上图，H2O2（200 mM）处理mTC和mTN细胞24 h后的BACH1的蛋白质印迹图。下图，两次实验BACH1蛋白条带的灰度值定量。ACTIN是内参。
（H）用1mM NAC处理A549细胞2周后游离血红素的稳态水平。红条，阳性对照：200 mM H2O2处理细胞过夜以刺激游离血红素的释放。
（I）将1 mM NAC或100 mM Trolox处理A549细胞2周后，用pCDNA-HS1传感器测得的游离血红素水平。将细胞与5 mM二酰胺孵育48小时作为阳性对照。
（J）左图，Western blot显示与10 mM血红素孵育24小时后细胞中BACH1和ACTIN的量。右图，BACH1的灰度值定量。
（K）Western blot显示与10 mM血红素孵育的细胞中BACH1和ACTIN的量。在添加血红素之前，将细胞与10 mM MG132、1 mM硼替佐米或2 mM MLN4924孵育30分钟。
（L）Western blot显示与20 mg / mL环己酰亚胺（CHX）孵育的细胞中BACH1和ACTIN的量。在CHX处理之前，将细胞与10 mM MG132、1 mM硼替佐米或2 mM MLN4924孵育30分钟。

3. BACH1是抗氧化剂诱导转移所必需的，并且能够在缺乏抗氧化剂的情况下诱导转移。
 

图3: BACH1是抗氧化剂诱导的转移所必需的，并且可以在缺乏抗氧化剂的情况下诱导转移

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（A）左图，与10 mM血红素孵育24小时的mTC和mTN细胞的Transwell迁移分析。右图，是迁移细胞的代表性照片。
（B）Western blot显示用CAS9和sgRNA靶向转染敲除mTC和mTN细胞中的BACH1后，BACH1的表达量；sgRNA靶向敲除dTomato（Tom）被用作对照。HISTONE 3（H3）是内参。
（C）左图，mTN-sgBach1，mTN-sgTom和对照mTC细胞的Transwell迁移分析（n = 2）。右图，是迁移细胞的代表性照片。
（D）左图，在静脉注射对照和缺乏Bach1的mTC和mTN细胞3周后，NSG受体小鼠肺肿瘤负荷情况。右图，代表肺切片染色。
（E）动物造模：气管内注射编码Cre重组酶，CAS9和gRNA sgTom或sgBach1的pSECC慢病毒。
（F）在气管内注射pSECC-sgTom或-sgBach1慢病毒后8个月，在KP小鼠中的肿瘤转移发生率；慢病毒感染后1周，应在日常饮食中服用维生素E（VitE，0.5 mg / kg）。
（G）CRISPR / sgBach1-SAM策略的示意图。sgRNA将CAS9-VP64融合靶向Bach1启动子，刺激内胚层基因的转录。
（H）左图，Western blot显示了SAM-sgBach1转导的mTC细胞中BACH1的量；对照细胞接受非靶向构建体（SAM-sgTom）。H3和ACTIN是内参。右图，在两次实验中灰度值分析BACH1的量。
（I）mTC-SAM-sgBach1和mTC-SAM-sgTom细胞的Transwell迁移。右图，迁移细胞的代表性照片。
（J）mTC-SAM-sgBach1和mTC-SAM-sgTom细胞的Transwell入侵检测。
（K）静脉注射3周后NSG小鼠的肺肿瘤负荷。注射mTC-SAM-sgTom，mTC-SAM-sgBach1和mTN细胞（0.5×105个细胞/小鼠；n =5-10）。

4. 编码糖酵解酶HK2和GAPDH的基因是BACH1的靶点。
 

图4: 基因组占有率和转录组学分析相结合，将Hk2和Gadph鉴定为BACH1靶基因/span>

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（A）左图，Venna图显示ChlP-seq分析（绿色）中BACH1结合的240个基因与RNA-seq分析中调控的基因（蓝色）重叠。右图，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的STRING分析确定了240个基因中的三个簇.
（B）20个“代谢过程”基因图.
（C）mTC和mTN细胞（n=3）的RNA的qPCR分析。
（D）上图，WB显示了mTC和mTN细胞中HK2和GAPDH的量。下图，灰度值分析结果。
（E）图左侧，HK2和GAPDH转录起始位点（TSS）上游300bp的BACH1结合位点的鉴定。红色箭头显示用于Chlp-qPCR的引物。图右侧，将包含野生型BACH1基序（蓝色）或突变基序（红色）的400-500bp启动子序列克隆到pGL3荧光素酶报告载体中。
（F）HK2启动子区域中的BACH1富集（与对照lgG整合相比）。N=2。
（G）Gadph启动子区域中的BACH1富集（与lgG结合相比）。N=2值。
（H）报道的HK2启动子活性载体的荧光素酶活性（如E图所示），并转染到具有和不具有BACH1表达的mTC和mTN细胞中。
（I）报告GAPDH启动子活性载体的荧光素酶活性。

5. 抗氧化剂以依赖BACH1的方式刺激糖酵解。
 

图5: 抗氧化剂以依赖BACH1的方式刺激糖酵解

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（A）由Seahorse分析判断，mTC和mTN细胞（n = 3）中的糖酵解速率，数据被标准化为mTC。 
（B）基本OCR和ECAR的比率（n = 3）。
（C）葡萄糖摄取和乳酸分泌（n = 3）。
（D）热力图显示了RNA-seq分析中鉴定的糖酵解基因的转录水平。
（E）BACH1和HK2，PFKFB3和SLC16A1在人肺癌中的共表达（173个数据集）。数据来自SEEK共表达数据库。
（F）mTC-SAM-sgBach1和对照mTC-SAM-sgTom细胞的糖酵解速率。
（G）（F）中细胞的乳酸分泌。
（H）mTC细胞、对照（sgTom）和缺乏Bach1的mTN细胞的糖酵解速率（n = 2）。
（I）（H）中细胞对葡萄糖的摄取。
（J）（H）中细胞的丙酮酸水平。
（K）（H）中的细胞的乳酸分泌。
（L）5 μM NRF2激活肽KI-696（n = 2）孵育24小时的mTC和mTN细胞的糖酵解速率。
（M）由RNA中的qPCR确定的Hk2和Gapdh表达，分离自在TC-696中孵育24小时的mTC和mTC-sgBach1细胞。
（N）（M）中细胞对葡萄糖的摄取。
（O）（M）中细胞的乳酸分泌。

6. 糖酵解介导抗氧化剂和BACH1依赖以及非依赖的迁移和转移。
 

图6: HK2刺激的糖酵解介导抗氧化剂和BACH1诱导的转移和侵袭性表型。

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（A）Western blot （顶部）显示了用对照质粒或编码人HK2的质粒转导的mTC细胞中HK2和BACH1的量及其糖酵解速率（底部）。
（B)（A）中所示的细胞迁移。
（C）静脉注射mTC和mTC-HK2细胞（0.5×105；n = 6只小鼠/细胞类型）3周后NSG小鼠的肺肿瘤负荷。
（D）皮下注射mTC和mTC-HK2细胞（0.5×105；n = 17和18只小鼠/细胞类型）5周后NSG受体小鼠淋巴结（LN）转移的发生率。。
（E）（D）中小鼠淋巴结转移的尺寸单位为mm3。
（F）（D）中小鼠皮下肿瘤的初级重量。
（G）对照质粒或G6PC3催化亚基编码的质粒转导的mTN细胞的糖酵解速率。
（H）（G）中的细胞迁移。
（I）静脉注射mTN和mTN-G6PC3细胞（0.5×105；n = 6只小鼠/细胞类型）3周后NSG小鼠的肺肿瘤负荷。
（J）Western blot显示逆转录病毒转导两种不同的Hk2 shRNA后，mTC-SAM-sgTom和mTC-SAM-sgBach1中HK2的水平。
（K）在（J）中细胞的糖酵解速率。
（L）左图，逆转录病毒转导Hk2 shRNA后，mTC-SAM-sgTom和mTC-SAM-sgBach1的Transwell迁移分析。右图，是迁移细胞的代表性照片。
（M）由Seahorse分析判断，mTC和mTN细胞中糖酵解衍生的ATP产生速率（n = 3）。
（N）由Seahorse分析判断，mTC和mTN细胞中的总ATP产生速率（n = 3）。
（O）mTC和mTN细胞中的稳态ATP水平（n = 3）。
（P）mTC和mTN细胞中有无BACH1表达的稳态ATP水平（n = 2）。

7. 靶向糖酵解可阻止抗氧化剂和BACH1诱导的转移。
 

图7: 靶向糖酵解可抑制抗氧化剂和BACH1诱导的迁移和转移

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（A）抑制剂（红色）和活化剂（绿色）的糖酵解示意图，用于定义酶促步骤在抗氧化剂增加细胞迁移能力中的作用。蓝色椭圆形，与mTC细胞相比，mTN细胞中蛋白质的基因增加。红色椭圆形，基因在mTN细胞中减少。
（B）经糖酵解抑制剂2-DG处理48小时后（n = 3）的mTC和mTN细胞存活率。数值代表未经处理的mTC细胞百分比。
（C）经50μM氯尼达明（LND，一种糖酵解抑制剂）和25μM 3-BP处理24小时后的mTN细胞（n = 3）糖酵解速率。
（D）经1 mM 2-DG处理mTC和mTN细胞（n = 3）的迁移分析。
（E）经50 mM LND处理的mTC和mTN细胞（n = 3）的迁移分析。
（F）经25μM糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸盐（3-BP）处理的mTC和mTN细胞（n ＝ 3）的迁移。
（G）经25 μM 3-BP处理24小时的mTC和mTN细胞（n = 3）的糖酵解速率。
（H）经10 mM丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂二胆乙酸酯（DCA）处理的mTC和mTN细胞的迁移。
（I）经1mM和10 mM的乳酸分泌抑制剂AZD3965处理的细胞迁移。
（J）静脉注射mTC和mTN细胞（0.5×105；n = 3~9小鼠/条件）3周后NSG小鼠的肺肿瘤负荷。从细胞注射的第二天开始，给小鼠给药四次（1 次/天）AZD3965（100mg / kg，灌胃）或3-BP（10mg / kg，腹膜内）。
（K）静脉注射3周后NSG小鼠的肺肿瘤负荷。注射mTC-SAM-sgBach1细胞（0.5×105；n = 4只小鼠/条件）。从细胞注射后的第二天开始，给小鼠注射四次（1 /天）3-BP（10mg / kg，腹膜内）。
在（D）-（F），（H）和（I）中，y轴显示细胞迁移占细胞损伤修复的百分比。
    在本研究中，高BACH1水平在低NRF2活性的情况下刺激转移，并且BACH1可以通过外源性和内源性抗氧化剂来稳定。重点是，作者发现BACH1在没有抗氧化剂的情况下是亲转移的。NRF2的激活，就像补充抗氧化剂一样，增加Hk2和Gapdh的转录，刺激糖酵解，并以BACH1依赖的方式增加幼稚肺癌细胞的迁移。 因此，含有NRF2/KEAP1突变的癌细胞的一个可能的优势是激活BACH1诱导的糖酵解。
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2. CELL: Nrf2激动剂通过抑制Bach1的降解促进肺癌的转移

纽约大学医学院Thales Papagiannakopoulos和 Michele Pagano团队团队
 
无独有偶，几乎在上篇文献发表的同时，来自纽约大学医学院的科学家团队也在Cell杂志发表文章，表明Nrf2能够通过抑制Bach1的降解导致肺癌的转移。有了上篇文章的基础，下面咱们简单介绍下该篇文章。
抗氧化基因的转录增加，一方面是通过获取更稳定的Nrf2突变体（Nrf2是细胞抗氧化程序的主要转录调控因子），另一方面是通过失活负调控因子。Keap1是一种依赖于Cul3的泛素连接酶（CRL3），在生理条件下，它起着降解Nrf2的功能。在氧化压力条件下，Keap1-Nrf2的结合受到抑制，Nrf2因此得以稳定。Keap1的突变和LUAD（肺腺癌）晚期转移和不良预后相关，表明Keap1的缺失可能在转移相关的级联反应中扮演重要角色。
研究人员在KP（KrasLSL-G12D/+; p53flox/flox）小鼠中敲低Keap1（KPK）发现实验结果与临床数据一致，Keap1敲低可导致细胞侵袭、转移增强，同时激活Bach1和血红素氧合酶-1（Ho1）的转录。Bach1是细胞内的血红素分子传感器，能够跟随着血红素水平的波动来调控基因转录。大多数的氧化应激都会引起血红素从血红蛋白中释放，导致更多的氧化应激，因为游离的血红素催化大量自由基产生，细胞通过多种机制避免游离血红素的促氧化作用，尤其是通过快速诱导Ho1分解游离血红素。
Bach1，Nrf2和Mafs转录因子，共同调控Ho1和其它抗氧化基因的表达。Bach1与Mafs形成异二聚体，诱导包括Ho1在内的抗氧化靶基因的转录激活，从而抑制Mafs的识别因子结合。在氧化压力下，Nrf2因为Keap1的失活而得以积累，而游离血红素的升高促进Bach1依赖于蛋白酶体降解。值得注意的是，除了在Maf-Nrf2通路中发挥作用外，Bach1还通过激活关键转移基因的转录促进肿瘤侵袭和转移。结果证实，Keap1缺失之后，是通过诱导Nrf2依赖的Ho1的表达来促进Bach1的积累（图1）。
 
图1. Keap1的缺失通过诱导Nrf2依赖的Ho1表达来促进Bach1的积累

那么Bach1的降解具体是由哪一个分子介导的呢？作者通过Co-IP实验证实是Fbxo22和Bach1直接相互作用。Fbxo22是CRL1泛素连接酶复合物的一个底物受体。作者证实了它是参与血红素水平导致的Bach1清除的具体分子。作者进一步验证了Fbxo22缺失，会导致Bach1的转录程序并促进细胞迁移。而过表达Fbxo22或抑制Ho1则会阻止Bach1驱动的肺癌转移（图2）。
 

图2.过表达Fbxo22或抑制Ho1阻止Bach1驱动的肺癌转移

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该篇文章表明，靶向血红素途径的药物，对Keap1-Nrf2途径发生改变的LUAD患者，尤其是对那些需要阻止肿瘤转移的患者来说，可能预示着一种新的治疗药物的出现。因此，Keap1突变型LUAD肿瘤中的这种机制的发现，可能为抑制肿瘤转移提供了新的治疗方案。
 

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