小优细节君： Actin也能多条带？

Actin相信大家再熟悉不过了，无论做哪个蛋白的Western，它总是不离不弃，需要你一直带着。它也是真核生物中含量最丰富的蛋白质之一，含量丰富意味着容易检测。大家回忆一下，第一次做Western是不是就是做的actin。可偏偏最简单的事情，却很难每次都做出完美的条带，总会出一些意想不到的结果。

△点击放大图片

如果内参actin跑不好，其他目的蛋白想跑出漂亮条带的难度也会大大增加，就好比地基没打好，很难建成高楼。今天小优细节君就来帮大家分析下为什么actin会有多条带？
 

【蛋白特性】
Western实验最重要的两个因素，一是蛋白，二是抗体。要探究原因，必须从源头出发，我们先看看蛋白特性。
研究发现，有很多蛋白酶可以降解actin，使原本42KDa的actin变成更短的片段， 40-41 KDa、37 KDa、30-32KDa、10-15 KDa等。
图1是凝血酶Thrombin作用不同时间后G-actin和F-actin的降解情况，主要生成37KDa（K），27KDa（L）和10KDa（M）条带。

图1
△点击放大图片

图2是组织蛋白酶Cathepsin L作用不同时间后actin的降解情况，先生成40KDa和30KDa的条带，随着时间增加，又出现了37KDa的条带。 

图2
△点击放大图片

图3是弹性硬蛋白酶（PMN-Elastase）剪切actin的情况，生成了37KDa的条带，剪切位点在Val43 and Met44之间。

图3
△点击放大图片

图4是白介1β转化酶（ICE）作用不同时间后actin的降解情况，先生成了41KD的条带，随着时间增加，又出现了30KD和14KD的条带。 

图4
△点击放大图片

图5是半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）剪切actin的情况，和ICE酶类似，凋亡情况下，actin会被剪切，产生多条带。而被 caspase-3 剪切的actin，会被泛素/蛋白酶体加速降解。

图5
△点击放大图片

还有许多尚未发现的酶都有可能对actin有剪切和降解作用，看到这里，有小伙伴会问，我做的课题又没加这些酶，为什么还是会有多条带呢？
其实不然，像上面提及的凝血酶、组织蛋白酶等是本身存在且广泛分布的，在提取蛋白的过程中就会将它们释放出来，成为降解actin的“凶手”。为什么我们一直强调制样要加入蛋白酶抑制剂，以及冰上操作，就是为了抑制这些酶的活性。

那是不是加了蛋白酶抑制剂就万事大吉了呢？
研究发现，即使添加了多种蛋白酶抑制剂，包括杆菌肽（bacitracin），亮肽素（leupeptin），抑肽素（pepstatin），抗蛋白酶（antipain），苯甲基磺酰氟（PMSF）等，还是无法抑制凋亡对内参的降解（图6）。所以，我们还要尽量保持细胞处于良好的状态和较低的传代次数，避免发生凋亡。而对于研究凋亡的小伙伴来说，需要根据具体情况选择合适的抗体或者考虑其他内参。

图6
△点击放大图片

【抗体特性】
这时又小伙伴又问了，我按照要求制样之后还有多条带，怎么办呢？
前面我们提到了Western的两大影响因素，除了蛋白本身，我们还可以从抗体入手，工欲善其事，必先利其器。Actin最常见的剪切片段是37 kDa，是因为许多酶都会在N端进行剪切，大概在Val43，或者更靠近N端的位点。这时我们可以在选择抗体的时候花一点“小心思”，尽量选择免疫原在N端，并且比剪切位点更靠近N端的抗体，就可以尽量“避免”识别剪切下来的片段，从而获得单一条带。这里需要注意，此时我们获得的Western结果虽然是单一条带，但不能反映样本本身是否降解或剪切。如果剪切位点在靠近C端的位置，抗体也会识别大片段。
还有一点需要注意，actin的N端序列在物种间的保守程度不如C端，因此这类抗体识别的种属范围不如其他C端抗体或者多克隆抗体广，但特异性较高。

总结一下，如果你在实验中发现actin的条带总是出现其他固定位置的条带，比如37 kDa、30 kDa等，很有可能就是酶的作用使actin发生了剪切。建议使用新鲜的组织或者健康的细胞进行重新制样，制样过程中充分抑制蛋白酶活性。选择抗体尽量选择N端单克隆抗体，可以事半功倍。希望大家都能做出完美的actin单一条带~

部分推荐产品：

参考文献：
1.    S Yamashita, et al. Characterization of a Protease Responsible for Truncated Actin Increase in Neutrophils of Patients with Behçet’s Disease. Biol Pharm Bull. 2001 Feb;24(2):119-22. 
2.    L Muszbek, et al. Cleavage of Actin by Thrombin. Proc Natl Acad Sci USA. 1974 Jun;71(6):2208-11.
3.    U Matsukura, et al. Mode of degradation of myofibrillar proteins by an endogenous protease, cathepsin L. Biochim Biophys Acta. 1981 Nov 13;662(1):41-7.
4.    C Kayalar, et al. Cleavage of actin by interleukin 1 beta-converting enzyme to reverse DNase I inhibition. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Mar 5;93(5):2234-8. 
5.    Jie Du, et al. Activation of caspase-3 is an initial step triggering accelerated muscle proteolysis in catabolic conditions. J Clin Invest. 2004 Jan;113(1):115-23.