蛋白A、蛋白L和KappaSelect亲和树脂已被广泛用于抗体纯化。蛋白A主要与抗体Fc端结合，蛋白L和KappaSelect分别与κ轻链(LC)的可变区和恒定区结合，并且与这些亲和树脂结合的抗体通常都在低PH下洗脱。最近有研究表明，除pH外，流动相中的盐浓度也对抗体保留率有影响。比如，高盐会提高抗体保留率。
为了评估在这三种类型的亲和层析中流动相中的盐浓度对抗体保留时间的影响，这里选取了3种不同的抗体(一种单特异性抗体和两种双特异性抗体（bsAbs），如图1所示)，开展了一系列重复研究。
图1.三种抗体示意图
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(A)常规单特异性抗体。(B)WuXiBody格式的不对称双特异性抗体(bsAb)。(C)Fab x单链可变片段(scFv)格式的不对称bsAb。在WuXiBody中，通过用T细胞受体(TCR)恒定域替换CH1/CL区，可以促进所需的重链(HC)-LC配对。对于B和C，通过旋钮入孔技术促进了重链异二聚。B和C具有一个LC恒定区，因此具有一个KappaSelect结合位点。
实验方法
1、蛋白质A色谱法
MabSelect SuRe LX：柱体积（CV）3ml；上样载量：30/2mg蛋白/ml树脂；保留时间：5min。
上样后，连续用50 mM Tris-HAc、150 mM NaCl、pH 7.4和50/20/10 mM柠檬酸盐、pH 4.5洗涤柱，5CV/次。最后，用100%的50/20/10 mM柠檬酸盐(pH 2.5)，在30 CV下用线性pH梯度洗脱色谱柱。
2、蛋白质L色谱法
Capto L：柱体积（CV）3ml；上样载量：10/2mg蛋白/ml树脂；保留时间：5min。
Capto L程序的详细信息
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3、KappaSelect亲和层析
KappaSelect亲和树脂：柱体积（CV）3ml；上样载量：2mg蛋白/ml树脂；保留时间：5min。
上样后，用50 mM Tris-醋酸盐、150 mM NaCl、pH 7.4、50/20/10 mM柠檬酸盐、pH 4.5连续洗涤，5CV/次。最后，用100%的50/20/10 mM柠檬酸盐(pH 2.5)，在30 CV下用线性pH梯度洗脱色谱柱。
实验结果
1、梯度缓冲液中盐浓度对Protein A色谱中抗体保留的影响
单特异性抗体(图1A)用于本部分研究。当柱以蛋白质A树脂的典型密度(即每毫升树脂30毫克蛋白质)加载时，盐浓度的差异对保留率的影响相对较小(如图2A)。在梯度缓冲液中，结合抗体在pH值略微升高、盐浓度降低的情况下洗脱。当柱以显著降低的密度(即每ml树脂2 mg蛋白质)加载时，盐对保留的影响变得更加明显(如图2B)。在显著升高的pH值和降低的盐浓度下洗脱抗体。具体而言，当梯度缓冲液含有50 mM、20 mM和10 mM盐时，洗脱峰开始时的pHs分别为3.70、3.75和3.85。数据表明，降低流动相中的盐浓度会削弱抗体结合，因此允许在不太严格的条件下洗脱。
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2、梯度缓冲液中盐浓度对Protein L色谱中抗体保留的影响
使用图1中三种抗体进行实验研究，对应结果图分别为图3.A、B、C。对所有三种抗体观察到相同的趋势:在降低的盐浓度下，结合到柱上的抗体在升高的pH下洗脱。数据表明，盐浓度对蛋白L色谱中抗体保留率的影响大于蛋白A色谱。例如，对于使用单特异性抗体进行的运行，当梯度缓冲液中的盐浓度从50 mM降至10 mM时，洗脱开始时的pH值Protein A和Protein L色谱分别为从3.7至3.85和从3.6至4.0(请参见图2B和图3A）。以前的研究中表明，WuXiBody形式的bsAb(图1B)对条件敏感，暴露于低pH时会形成大量聚集体。因此，当在较高盐浓度(即50 mM)下洗脱需要较低pH时，洗脱峰会分裂(图3B，黑线)。对于Fab x scFv格式的bsAb(图1C)， 还包含一定量的Fab x Fab同二聚体副产物，洗脱时间比Fab x scFv异二聚体更早，导致色谱图中有一个较小的早期洗脱峰(图3C)。值得注意的是，从图3C中可以看出，Fab x Fab同二聚体和Fab x scFv异二聚体之间的分辨率随着盐浓度的增加而提高，这与之前的报道一致。
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3、梯度缓冲液中盐浓度对KappaSelect色谱中抗体保留的影响
使用图1中三种抗体进行实验研究，对应结果图分别为图4.A、B、C。观察到所有三种抗体的趋势相同:在降低的盐浓度下，在升高的pH下洗脱与柱结合的抗体。数据显示，在KappaSelect色谱中，盐浓度对抗体保留率也有较大影响，与Protein L色谱柱相当。对于含有两个轻链恒定区(有两个KappaSelect结合位点)的mAb，洗脱峰的尾部显着，尤其是在高盐浓度(即50 mM)下(图4A)，这表明该抗体在高盐浓度下具有很强的结合力。在这种情况下，需要较低的pH值进行洗脱。对于含有一个轻链恒定区(有一个KappaSelect结合位点)的两种bsAb，尽管在高盐浓度下(即50 mM)明显出现尾峰，但洗脱在所有三种盐浓度下都相对完成(图4B和C)。
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4、新发现在Capto L中用于低pH敏感性bsAb的应用
从先前和当前研究中了解到，所研究的WuXiBody形式的bsAb对低pH值敏感，并且在从Capto L柱洗脱期间显示出易形成聚集体的趋势。Capto L洗脱液中聚集体的总含量比相应的蛋白A洗脱液中的高约20%。在之前的研究中，通过在洗脱前加入高pH值的清洗液(可稳定bsAb ),将聚集降至最低.这种方法将Capto L洗脱液中的聚集体总含量降低至约13.5%，仍比蛋白质A洗脱液的相应值高约3%。这里，我们除了先前采用的策略外，还略微提高了另一个洗涤步骤的pH(该洗涤缓冲液的电导率相应降低)，目的是去除弱结合的LC缺失副产物。结果表明，降低电导率会削弱副产物的结合，因此洗涤步骤可以在更高的pH值下进行，同时仍然可以实现同样有效的副产物清除（如图5）。
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结论
流动相中盐浓度对两个轻链结合亲和力色谱柱中抗体保留的影响远比对Protein A色谱柱更大。尤其是对于Protein L和KappaSelect色谱，将梯度缓冲液中的盐浓度从50 mM降低到10 mM，可使洗脱pH值增加约0.5个单位(即从2.9到3.4)。因此，通过降低流动相中的盐浓度，可以在较温和的条件下实现洗脱。这对于对恶劣条件敏感的抗体特别有用。正如低pH敏感性抗体所证明的那样，通过稍微降低pH值(可通过降低洗涤缓冲液中的电导率实现)的副产物清除洗涤，再结合洗脱前的高pH值洗涤，可以大大降低低pH值触发的聚集。总之，本研究可以为使用Protein L或KappaSelect亲和层析纯化低pH敏感性抗体的洗脱增加聚集提供一种解决方案。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33157199/
文末彩蛋
抗体层析应用指南
抗体也叫免疫球蛋白（Ig），是一大类能与抗原产生特异性结合的蛋白，现在常见的治疗性抗体药物包括：全抗、抗体片段、ADC、双抗等。
（1）全抗和Fc融合蛋白的平台技术
全抗和Fc融合蛋白的平台纯化技术包括一个基于Protein A的捕获步骤和1-2个精细纯化步骤。
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（2）抗体片段纯化平台
抗体片段（例如：Fab，scFv，Dab等）也是一类非常重要的生物类资料药物。由于抗体片段在结构上缺少Fc段，因此不能使用与Fc段特异性结合的Mabselect SuRe和Mabselect SuRe LX等介质来进行亲和捕获。但是耐碱性改造后的Mabselect PrismA保留了与抗体重链可变区的结合能力，因此该填料是可以用于抗体片段的亲和捕获纯化阶段。同时，针对不同的位点，我们提供了Capto L（结合kappa型轻链的可变区）kappaSelect和LambdaFabSelect（分别结合kappa和Lambda轻链的恒定区）等亲和填料。精细纯化可采用经典阴阳离子层析纯化，也可采用复合模式填料。
（3）双特异性抗体纯化平台
双特异性抗体（BsAbs）是抗体药物的衍生物，具有结合两个相同或者不同表位的能力的抗原。从结构上来说，双特异性抗体可以分为两大类，即带有Fc段的（IgG-like BsAbs）和不带有Fc段的（Non-IgG-like BsAbs）。对于IgG-like BsAbs的纯化，由于其细胞培养过程中存在多种不同的产品相关杂质，会采用不同的层析纯化手段。
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对于Non-IgG-like BsAbs的纯化平台可以参考抗体片段类药物的纯化平台。
（4）抗体药物偶联物层析纯化
抗体药物偶联物，即Antibody-drug Conjunctions，ADCs，是将化学毒素小分子与单克隆抗体进行偶联，利用单抗药物的靶向性将毒素直接带入肿瘤细胞进行杀伤，既降低了毒素小分子的毒性，同时又增加了单抗药物的治疗效果。ADCs药物的单抗部分纯化可以采用抗体纯化平台工艺进行。单抗药物与毒素的偶联工艺，毒素小分子的去除一般采用脱盐（Sephadex G 25）或者超滤的方式进行。
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| 17547802 | capto t | 200 mL | 10 mglmL | 85 | 约25 mg人类Fab | 纯化广泛的抗体片断.例如Fabs,单链可变区片断(scFv和区域抗体(Dabs)包括kappa的轻链 | 500 | 2-10 |
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