GST标签蛋白纯化策略

在蛋白研究中，想获得可溶性蛋白，我们会优先考虑GST融合蛋白表达系统。

除了提高可溶性，GST融合蛋白表达还有纯度高、纯化条件温和、蛋白活性不受影响等优势，也是大家经常用的标签融合蛋白表达系统。

最近也有很多科研小哥哥、小姐姐来咨询小优GST标签蛋白纯化的相关问题，今天小优先对GST标签蛋白的纯化方法原理和步骤进行详细地梳理，小伙伴们快来围观吧！

GST纯化原理

GST（谷胱甘肽S-转移酶）能特异地与其底物谷胱甘肽结合。据此原理，融合有GST标签的目的蛋白可以与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异结合，再用酶将GST标签切除，即可得到单纯的目的蛋白。

GST纯化流程

一、材料准备

预装柱：GSTrap HP 或 GSTrap FF

结合缓冲液：PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)，pH 7.3

洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl, 10 mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.0

注意：为了避免GST上自由-SH基团的氧化，引起目的蛋白的聚集，可以适当在结合或洗脱缓冲液中添加1-10 mM的DTT。

二、实验流程

样品准备

样品上样前应离心并通过0.45μm滤器过滤。如果样品太粘稠，请用结合缓冲液稀释以防止堵塞层析柱。

蛋白纯化

1. 系统设置一个低流速，移除层析柱顶部的堵头，把柱子连接到 ӒKTA 纯化仪的接头上，注意要液滴对液滴进行连接，防止引入气泡；

2. 去除柱子底部的堵头，连接到纯化仪上；

3. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡层析柱；

4. 用上样环或者superloop加入预处理的样品（样品在上柱前需进行离心和过滤），在上样时建议流速为 0.2-1 ml/min（1ml 体积柱子）和 1-5 ml/min（5ml 体积柱子）；

5. 用结合缓冲液洗涤5到10个柱体积，直到吸收峰达到稳定基线或在流出物中没有物质流出。洗涤过程中建议流速为 1-2 ml/min（1ml 体积柱子）和 5-10 ml/min（5ml 体积柱子）；

6. 用5到10个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。在洗脱过程中建议流速为 1-2 ml/min（1ml 体积柱子）和5-10 ml/min（5ml 体积柱子）。

（如果进行柱上酶切，第6步省略直接进行后续的酶切步骤）

GST标签的去除

如果GST标签需要切除，包含 PreScission™ 蛋白酶识别位点、Thrombin识别位点或Factor Xa识别位点的标签蛋白可以在与GSTrap预装柱结合时或在洗脱后进行标签去除。

一般来说，柱上酶切是推荐的方法，因为许多潜在的杂质都能被洗掉，目的蛋白洗脱时具有更高的纯度。如果切割条件需要优化，建议在洗脱后进行标签去除。

以下GST标签的去除方法都是柱上切除，如果想要了解GST标签蛋白洗脱后切除的方法，可以在下方留言联系小优哦！

PreScission 蛋白酶

注意：PreScission 蛋白酶使用需要在4度进行。

PreScission 蛋白酶, Mr 46 000

PreScission 切除缓冲液: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), pH 7.5

PreScission 蛋白酶对目的蛋白标签进行柱上切割

紧接以上蛋白纯化的第5步：

6. 用10倍柱体积的PreScission切除缓冲液冲洗柱子；

7、准备PreScission蛋白酶混合液：

对于1ml GSTrap 预装柱（结合8mg GST标签蛋白）：

将80μl（160 units）PreScission 蛋白酶和920 μl PreScission 切除缓冲液在4℃进行混合；

对于5ml GSTrap 预装柱（结合40mg GST标签蛋白）：

将400μl（800 units）PreScission蛋白酶和4.6ml PreScission 切除缓冲液在4℃进行混合；

8、将PreScission蛋白酶混合物上样到柱子里，柱子的上端和下端分别用堵头堵住，在4℃孵育4 h；

9、去除柱子堵头，用3ml（1ml预装柱）或 15ml（5ml预装柱）的PreScission 切除缓冲液冲洗柱子并收集流出液（0.5-1ml每管）。此时流出液中仅包含切除标签后的目的蛋白，GST标签和PreScission蛋白酶仍结合在柱子上。

10、用5到10个柱体积的洗脱缓冲液清洗残留柱子上的GST标签和蛋白酶。

11、结合缓冲液冲洗5个柱体积，充入20%乙醇保存。

Thrombin 蛋白酶

Thrombin， Mr 37 000

Thrombin切除缓冲液：PBS, pH 7.3

Thrombin溶液的制备：

1、在冷的500 μl PBS (1 U/μl) 中溶解 500 U Thrombin。

2、轻轻震荡以溶解。

3、分成80 μl每管，在 -80°C冷冻保存。

Thrombin凝血酶对目的蛋白标签进行柱上切除

紧接上面蛋白纯化的第5步

6、制备Thrombin凝血酶混合液：

对于1ml GSTrap 预装柱（结合8mg GST标签蛋白）：

将80μl（1 U/μl）Thrombin溶液和920 μl PBS进行混合；

对于5ml GSTrap 预装柱（结合40mg GST标签蛋白）：

将400μl（1 U/μl）Thrombin溶液和4.6ml PBS进行混合；

7、将Thrombin凝血酶混合物上样到柱子里，柱子的上端和下端分别用堵头堵住，在室温（22℃-25℃）孵育2-16 h；

8、去除柱子堵头，用3ml（1ml预装柱）或 15ml（5ml预装柱）的PBS冲洗柱子并收集流出液（0.5-1ml每管）。此时流出液中包含切除标签后的目的蛋白和Thrombin蛋白酶，GST标签仍结合在柱子上。

9、用5到10个柱体积的洗脱缓冲液清洗残留柱子上的GST标签。

10、结合缓冲液冲洗5个柱体积，充入20%乙醇保存。

注意：可以用HiTrap Benzamidine FF（Cytiva，货号17514302,17514301,17514401）去除洗脱液中的Thrombin蛋白酶，收集的洗脱液即为较纯的目的蛋白。

Factor Xa

Factor Xa, Mr 48000

Factor Xa由二硫键连接的两个亚基组成，由于谷胱甘肽可以破坏二硫键，所以需要在切除反应之前从样品中去除谷胱甘肽。

Factor Xa切除缓冲液：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.5

Factor Xa溶液的制备：

1、将 400 U Factor Xa 溶解在 400 μl 预冷蒸馏水 (1 U/μl) 中。

2、轻轻震荡以溶解。

3、分成80 μl每管，在 -80°C冷冻保存。

Factor Xa对目的蛋白标签进行柱上切除

紧接上面蛋白纯化的第5步

6、用10倍柱体积的Factor Xa切除缓冲液洗涤柱子；

7、Factor Xa混合液的制备：

GSTrap 1 ml 柱（8 mg GST 标记蛋白结合）：将 80 μl Factor Xa溶液与 920 μl Factor Xa裂解缓冲液混合。

8、将Factor Xa混合液上样到柱中，柱子的上端和下端分别用堵头堵住， 将柱子在室温(22-25℃)下孵育2-16h;

9、去除柱子堵头，用3ml（1ml预装柱）或 15ml（5ml预装柱）的Factor Xa切除缓冲液洗脱目的蛋白，然后收集目的蛋白（每管0.5-1ml）。洗脱液中含有目的蛋白和Factor Xa。

注意：可以用HiTrap Benzamidine FF（Cytiva，货号17514302,17514301,17514401）去除洗脱液中的Factor Xa，收集的洗脱液即为较纯的目的蛋白。

GST融合蛋白的纯化步骤就写到这里了，另外GST融合蛋白纯化可能还会有很多问题，比如GST融合蛋白和GSTrap FF不结合、GST融合蛋白不能被有效地洗脱下来、洗脱出的蛋白不纯等，具体解决方案让我们下期见吧！