脓毒症是一种由感染引起的严重的全身性炎症反应综合征，死亡率极高。全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5%～8.0%的速度上升。
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脓毒症被认为是一种严重的系统性炎症反应综合征，由宿主对感染的反应失调引起。脓毒症可发展为多个器官（脑、肺、肝等）功能障碍和脓毒性休克，是重症监护病房(ICU)最常见的死亡原因之一。脓毒症的原因很复杂，一般来说，脓毒症被认为涉及促炎反应和抗炎反应的早期激活，但免疫和炎症的详细过程仍不清楚。
外周血单个核细胞(PBMCs)在抗感染的免疫应答中起着关键作用，其成分和功能在脓毒症中发生了根本性的改变。本文描述脓毒症中PBMCs单细胞转录水平上的改变。
样本
7例脓毒症患者和4例供体中分离出的pbmc。
分离pbmc
按标准方法用肝素抗凝剂收集外周血(约10mL)，然后转移到50mL离心管中，用20mLPBS稀释。加入15mL Ficoll，轻轻混合。1500rpm/分钟，离心30分钟，将PBMC细胞层转移到另一个管中。加入足够的PBS，彻底混合，以1800rpm/min离心5分钟，然后弃用上清。上述所有实验均在4摄氏度的条件下进行。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)
所有样品均均匀复苏，PBS洗涤2次(0.1%BSA)，细胞用1ml染色缓冲液(0.1%BSA)并计数。所有样本的细胞活力评估>为80%。所有样本的细胞都用样本标记(BD人类单细胞复用试剂盒)进行标记，计数和多路复用，准备进行单细胞捕获。根据制造商的建议，BD Rhapsody系统进行单细胞捕获和cDNA合成。文库在Illumina的下一步seq上的多次运行中进行了测序。
结果
对6种细胞类型的PBMCs进行了分析，详细显示了T细胞和单核细胞的生物学特性。单核细胞可以聚集为6个亚群，在脓毒症驱动的组成、基因谱和信号通路的改变上具有很大的异质性。此外，在单核细胞1等单核细胞簇中，代表性基因的表达与脓毒症临床指标高相关。
# 单细胞水平上对照组和脓毒症患者pbmc的转录组谱 #
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(A)示意图显示PBMCs的转录组实验示意图；
(B)通过质量过滤的细胞数量和基因中位数(2个对照样本，CT1-CT2；7例脓毒症患者，SP1-SP7)；
(C)PBMCs的tSNE图显示6种细胞类型（左），条形图显示正常对照和脓毒症患者的细胞分数（右）；
(D)所有的细胞通过疾病状态（对照组和脓毒症）进行分化，以显示由脓毒症驱动的细胞簇的改变。
(E)二维tSNE可视化显示已建立的细胞标记物的表达水平。鉴定了6种主要的细胞类型，包括：B细胞(MS4A1+)、DC细胞(CD11b+)、单核细胞(CD68+)、自然杀伤细胞(CD3D−和NKG7+)、自然杀伤T细胞(CD56+)、T细胞(CD3D+)。
# T细胞的单细胞分析 #
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(A) 2簇T细胞的二维tSNE可视化，不同颜色代表不同的簇(细胞毒性T和辅助细胞)，（上、下）分别显示对照和脓毒症；
(B) 对照和脓毒症T细胞相关的代表性基因的表达分布，用小提琴图显示；
(C) 热图代表对照和脓毒症T细胞中表达的最高差异基因，20个基因在正常组中高表达，20个基因在脓毒症中高表达；正常和脓毒症诱导T细胞信号通路差异的；
(D)条形图。t统计，比较脓毒症与对照组的GSVA评分比较检验结果。GSVA，基因集变异分析。
# 单核细胞的单细胞分析 #
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(A) 二维tSNE可视化6簇单核细胞，不同颜色代表不同的簇(CCL3L1+单核细胞，CD14+NEAT1+CCR1+单核细胞，CD14+NEAT1+SELL+单核细胞，CD16+单核细胞，单核/巨噬细胞，NEAT1+CD163+单核细胞/DC)，分别显示对照和脓毒症；
(B) 与对照和脓毒症单核细胞相关的代表性选择基因的表达，小提琴图显示；
(C) 热图代表了对照和脓毒症单核细胞中表达的最高差异基因，20个基因在正常组中高表达，20个基因在脓毒症中高表达；正常和脓毒症诱导单核细胞信号通路差异的；
(D)条形图。t统计，比较脓毒症与对照组的GSVA评分比较检验结果。GSVA，基因集变异分析。
# 单核细胞簇在基因表达和信号通路的改变 #
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(A) 单核细胞的t-SNE可视化，不同颜色代表6个簇；[簇3(CD14+NEAT1+SELL+)；簇5(CD14+NEAT1+CCR1+)；簇6(CCL3L1+)；簇7(NEAT1+CD163+)；簇8（巨噬细胞）；簇11(CD16+)]，与原始簇相似。右（上、下）分别为正常对照和脓毒症患者PBMCs中的聚类百分比。
(B) 条形图；
(C，D)热图代表每个样本（2例对照混合和7例脓毒症患者）单核细胞第8和第11类表达的顶部差异基因，20个基因在正常组高表达，脓毒症高表达；
(E) 6个单核细胞簇中差异信号通路的分层聚类分析，红色和蓝色分别代表通路活性的增强和抑制。
# 脓毒症临床指标与脓毒症单核细胞群的关系 #
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(A)临床指标与PBMCs集群百分比的相关性；临床指标与集群6、7、8、11中代表性基因表达的。
(B)相关性。红色和蓝色分别表示正相关和负相关。
结论
虽然本研究是初步的，但揭示了脓毒症中PBMCs特异性及其相关通路的改变。这些结果提供了脓毒症驱动的组成、基因图谱和通路的全景，这为临床实践中了解疾病进展或治疗提供了一个独特的视角。
Reference：Single-cell transcriptomics reveals the alteration of peripheral blood mononuclear cells driven by sepsis.
