【小优细节君】为什么磷酸化AKT老是做不出？

AKT在多种级联信号传导机制中发挥着关键作用，因此它一直是基础研究和药物研发领域中热门的激酶之一。 那么在实验中检测AKT我们需要提前了解哪些信息，从而避免踩坑呢？

今天小优细节君就来和大家一起重温下AKT的相关知识。

AKT 

AKT也被称为蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)，是一种分子量约为60 kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶。

AKT在细胞的生长和凋亡等方面起到关键作用。在经胰岛素或各种生长及存活因子激活后，这个激酶在包括PI3K在内的通路中起作用。

目前，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶家族共发现了三种高度同源的亚型，即 AKT1（PKBα）、 AKT2（PKBβ）和 AKT3（PKBγ）。

在分布表达上，AKT1和AKT2存在较为广泛。AKT1通过抑制细胞凋亡过程从而促进细胞存活，被认为是许多类型癌症的主要因素。AKT2的表达在褐色脂肪、骨骼肌和肝脏等胰岛素反应组织中升高，是胰岛素信号通路中的重要信号分子，诱导葡萄糖转运。AKT3似乎主要在大脑中表达，在胶质母细胞瘤的生物学中也起着关键作用。

不过，在术语上PKB或AKT可能统称所有三个亚型，但有时也用于单独指代AKT1 / PKBα。 大家在看文献或是选择产品时都可以仔细确认一下哦~

图1  AKT结构域
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三种 AKT 同种型 (AKT1/2/3) 是具有共同结构的激酶，其由 3 个结构域组成，分别为： pleckstrin同源 (PH) 域、激酶结构域、调节结构域（RD）。

PH 域对 PIP3 有亲和力，对于和胞膜的结合至关重要。PH 域和激酶结构域在不同的AKT 异构体中都是相对比较保守的，其中，PH域约有60%的同源性，而激酶结构域的同源性则超过85%。

AKT 的主要磷酸化位点是苏氨酸和丝氨酸残基，分别位于激酶结构域 (T305/T308/T309) 和调节结构域 (S472/S473/S474)。

受多种细胞外刺激的刺激，各个AKT成员在不同环境中也具有广泛多样的下游效应。

接下来小优细节君将以 PI3K-AKT信号通路为例，对AKT的作用机制进行介绍。

 PI3K-AKT信号通路 

PI3K-AKT信号通路是一种响应细胞外信号并完成细胞内信号转导的途径，它与多个通路存在直接连接，如上游的Toll like receptor、B cell receptor、JAK-STAT信号通路和下游的蛋白翻译、细胞周期、细胞凋亡、P53信号通路等。

图2 PI3K-AKT信号通路
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KEGG数据库中展示的PI3K-AKT信号通路可以分为三大部分，分别为：

1.PI3K-AKT上游（图2 ①）

主要响应细胞外信号（图2中双竖线为细胞膜），以激活PI3K-AKT核心过程。

图3 PI3K-AKT信号通路的上游激活
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许多生长因子、激素与细胞因子通过结合其同源受体酪氨酸激酶（RTK）、细胞因子受体或GPCR，以及通过触发脂质激酶 PI3K 的活化来激活 AKT，从而在细胞质膜中生成 PIP3。

2.PI3K-AKT核心（图2 ②）

PI3K-AKT通路是通过一系列下游底物的丝氨酸或苏氨酸磷酸化介导的，涉及的关键基因是PI3K和AKT。

AKT激活经历了双重磷酸化。作为PI3K的下游蛋白，AKT主要有两个重要的磷酸化位点Thr308和Ser473，也分别对应着激酶结构域（被PDK1磷酸化）和调节域（mTORC2磷酸化）。

PI3K不能直接活化AKT, 它是通过与细胞内含有PH 结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，诱导AKT到细胞膜上，然后催化AKT的Thr 308位点发生磷酸化，从而部分激活AKT，但是AKT功能活性的充分发挥还需要Ser473的磷酸化。

在许多细胞系（尤其是肿瘤细胞系）中，对AKT功能的抑制多是通过抑制PI3K的功能（如使用PI3K特异性抑制剂LY294002和Wortmannin）而实现的，以p-AKT（Ser473）表达含量的降低为主要指标。

PTEN蛋白是PI3K-AKT信号通路的主要负调节蛋白，拮抗PI3K和AKT，使PIP3 脱磷酸，通过抑制AKT磷酸化并使其去磷酸化，使得细胞中的AKT磷酸化水平降低，从而阻断PI3K-AKT信号通路，抑制细胞生长，促进细胞凋亡。

3.PI3K-AKT下游（图2 ③）

PI3K-AKT信号激活后，会传递给下游通路，导致一系列通路被激活。

图4 PI3K-AKT信号通路的下游效应子及其细胞功能
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AKT激活后会磷酸化其下游靶标，这些蛋白如MDM2、TSC2、GSK3、FOXO、mTOR等，调控了细胞的生长、存活、增殖、糖代谢等一系列生命活动，进而参与了癌症、心血管疾病、糖尿病及神经系统疾病等的发生发展。

 p-AKT的位点选择

说到这，大家可能会有疑问：对于常见的p-AKT（Thr 308） 和 p-AKT（Ser 473） 位点，到底该选择哪个位点呢？

AKT激活的磷酸化顺序一般是先苏氨酸磷酸化后丝氨酸磷酸化。膜上的 PDK1 在 AKT 的Thr 308 位点将其磷酸化，导致 AKT 的部分激活。Ser 473 位点被 mTORC2 磷酸化，可激发AKT 的完全的酶活性。

因此，在选择位点的时候，可以从作用的激酶来推测哪一个位点可能会发生变化，最直接的位点是检测Ser473，如果两者都检测的话那自然是比较好的。

p-AKT的WB检测关键点

1.合理的诱导方式

磷酸化蛋白通常在样本中含量比较低，在制样时需要对样本进行 预刺激和 诱导处理，使目标蛋白磷酸化高水平表达。

WB结果信号弱或无信号可能意味着诱导不充分，样本处理是影响整个实验结果的关键，那么到底该如何处理样本才能得到理想的磷酸化AKT结果呢？

AKT的磷酸化发生得很快，信号也相对较快地消失。建议对样本做 短时间的处理，如用 Insulin, Calyculin A, PDGF ,EGF等处理 10-30分钟，对大多数细胞而言都可以得到AKT的磷酸化表达。

图5 样本经 LY294002/Wortmannin/PDGF 处理
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图6 样本经 Calyculin A/LY294002 处理
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2.超声处理样本

制备样本裂解细胞或组织时，裂解缓冲液需新鲜制备，并加入新鲜制备的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白降解及磷酸化蛋白发生去磷酸化。

在35-40%的功率条件下破碎3次，每次超声10秒，每次间隔10秒。如没有超声仪，可用1ml注射器针头，冰上反复抽打裂解液10次左右，达到类似于超声的效果。

3.足够的上样量

对于组织提取的蛋白，建议每个孔上样 100ug；而对于诱导的细胞系提取的蛋白，上样20-30ug即可。

4.同时检测总蛋白

在检测p-AKT的同时，需要同时检测样本中AKT的总蛋白量。

检测AKT总蛋白可验证样本中是否存在AKT，计算p-AKT与AKT的比例可说明AKT磷酸化程度。

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