二抗选择超全攻略，一秒收藏!

你是否在选择二抗的时候遇到过以下的情况：

IHC/IF多标实验中一抗二抗种属傻傻分不清？荧光标记不知道怎么选择？

IHC实验结果不准确，遇到高背景、假阳性的情况？

一抗种属来源相同时，不知该选择什么样的二抗来进行同步法IF双标记染色？

IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带？

别急，这篇超全的二抗选择攻略可以助你解决这些疑惑。

本文将从两个角度（1）二抗选择的基本步骤（2）不同的实验怎么选择二抗，来教大家如何在日常实验中选择二抗，干货满满，也可以先收藏后看哦~

Part 1 选择二抗的4个基本步骤

1.选择正确的种属来源和反应物种
二抗的选择首要基于一抗，应与一抗的种属来源相对应，且需要来自于不同的物种（如下图所示）。

图1.二抗种属反应物种应与一抗种属来源相同，且来源应与一抗种属来源不同。

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2.选择正确的二抗形式
选择合适且正确的二抗形式，也是获得实验成功的关键之一。三种二抗形式Whole IgG、F(ab’)2、Fab如下图所示。

图2. “Y”型的二抗分子可以被酶水解成两种不同的形式

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3.抗体特异性的选择
要注意区分二抗的特异性和形式的不同，特异性指的是二抗识别的不同一抗亚型或某特殊区域。抗体的特异性主要基于以下三种形式：
❖轻链特异性
❖Fc端特异性
❖亚型特异性

图3.免疫球蛋白的不同类型和亚型，以及不同亚型特异性二抗分子识别不同亚型样本示意图。

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4.偶联标记的选择
不同实验类型适合的标记类型不一样，如下表所示：

对于多标染色实验，下面有几种常用的配色参考（除细胞核染料外）：

 

 

Part 2 基于不同实验类型的二抗使用指南

1.常规WB实验选择Whole IgG全片段二抗
对于常规的WB实验，在基于正确的种属来源和反应物种原则上，我们一般选择酶标或生物素标记的没有特殊形式的全片段二抗。

常规WB部分相关二抗推荐：

 

2.荧光WB实验选择带有荧光基团的Whole IgG二抗
与化学发光WB实验所使用的酶标记二抗不同的是，荧光WB需选择带有荧光基团的二抗（如FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗）。此外还需要搭配有合适光源和滤光片的成像仪器，如奥德赛、Bio-rad等。

图4.使用带有Alexa fluor680和Alexa fluor790基团的二抗进行荧光WB实验的示意图

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荧光WB部分相关二抗推荐：

 

3.IP后WB实验根据目标蛋白分子量，选择轻链特异性二抗或Fc片段特异性二抗
在IP或 co-IP实验中，IP实验及之后的WB实验的操作过程中通常会用到相同的一抗或同种属来源的一抗、这种情况下，如果使用常规无特异性的Whole IgG酶标二抗，WB实验中IP抗体变性后产生的重链（55kDa）和轻链（25kDa）都能够识别， 而此非特异的信号往往会部分甚至完全掩盖目的蛋白的信号。

因此，当目标蛋白位于55kDa分子量附近时，需要选择抗轻链（anti-light chain）的二抗，以避免重链的干扰（如图11）；反之，当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，需要选择抗Fc端的二抗，以避免轻链的干扰。

此外，如果有同时去除轻链或重链干扰的实验需求时，还可以选择构象特异性（conformation specific）的二抗。

图11. （A）使用构象特异性二抗的WB结果，（B）使用抗轻链二抗的WB结果，（C）使用普通酶标Whole IgG无特异性二抗

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IP后WB部分相关二抗推荐：

 

4.IHC/ICC/IF实验选择F（ab’）2形式的片段二抗
在研究某些细胞和组织时（如白细胞群体：巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞等；某些组织：淋巴结，脾脏，外周血等），这些细胞或组织因表面Fc端受体过多，会与抗体分子中的Fc端相结合，从而导致非特异性结合和高背景的现象（如下图所示），俗称“假阳性”。

使用F(ab’)2形式的二抗可以避免其与活细胞中的Fc受体非特异性结合，还可避免与Protein A、ProteinG的非特异性结合，从而提高实验准确性。

图5.使用F（ab’）2片段二抗可以避免“假阳性”情况

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IHC/ICC/IF部分相关二抗推荐：

 

5.多标记染色IF/IHC实验选择经预吸附处理的二抗 
（1）为了防止二抗与样本，以及其他一抗种属的交叉反应，进行多标记实验的时候，首先需要选择经预吸附处理的二抗，以减少这种交叉反应；

（2）所有二抗都应尽可能的来自同一宿主物种，以此来限制二抗与来自其他物种的一抗之间的交叉反应。下图给出了一种三标实验搭配参考，因样本和三支一抗的来源分别为小鼠、山羊、兔及大鼠，应选择能够去除这几种种属交叉反应的二抗。

图6.进行三标染色实验时，实验样本为小鼠的二抗选择参考

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或直接使用二抗选择工具，让你的三标记染色实验不再难~

（3）如果一抗种属来源于不同的亚型，那么二抗则不需要来源于不同的物种，只需要选择对应的亚型特异性二抗即可，如图7所示。

图7.一抗种属来源于不同亚型的三标实验

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多标染色IF/IHC部分相关二抗推荐：

 

6.一抗来源相同的双染IF实验选择Fab形式的片段二抗
有时因受限于实际的实验条件，在进行双染色的IF实验时，一抗来源于同物种。这时可以选用Fab片段二抗来进行实验，这是因为每个Fab片段二抗只含有一个抗原结合位点，因此在随后的孵育过程中不会与另一个分子相结合(即在进行顺序双标记时的第二个一抗)。

以下有两种使用Fab片段二抗进行双标记染色的方法可供大家参考：

（1）来自同一种属的两种一抗均未标记时

图8.使用Fab片段二抗进行一抗来源相同的双染IF实验（参考一）

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（2）来自同一种属的一种未标记一抗和一种或多种标记的一抗

图9.使用Fab片段二抗进行一抗来源相同的双染IF实验（参考二）

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不建议使用F(ab’)2片段抗体进行双重标记实验，因为其为二价分子，含有两个结合位点。在与第一个一抗结合之后，第二个结合位点可能仍未被占据，而这个未被占据的结合位点能够与第二抗体结合，导致假阳现象。

Tips：Fab片段二抗还可用于封闭内源性免疫蛋白：
当一抗与所研究组织种属来源相同时(例如，小鼠一抗用于小鼠组织)，可以使用Fab片段二抗来阻断内源性免疫蛋白，以提高实验的准确性。

图10.（a）未封闭的内源性免疫蛋白会与随后加入的二抗分子结合，干扰实验（b）经过Fab封闭后， 内源性免疫蛋白不会与随后加入的二抗分子结合

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一抗来源相同的双染IF部分相关二抗推荐：