前几天，看到有人留言 “ELISA实验时，都会遇到哪些问题”
实验过程中，每个人遇到的问题都不一样
在这里，我列出了以下几点常见问题
一、阴性对照出现阳性结果
| 可能的原因 | 解决的方法 |
| 试剂/样品污染 | 试剂和样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂，小心操作移液器 |
| 夹心ELISA-检测抗体与包被抗体反应 | 确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体，他们之间不会相互反应 |
| 酶标板洗板不彻底 | 用洗液充满板空确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净 |
| 抗体量过多导致非特异性结合 | 根据推荐用量使用抗体尽量使用较少的抗体 |
二、酶标板整体背景高
| 可能原因 | 解决的方法 |
| 结合反应太强或时间过长 | 检查底物的稀释，使用建议的稀释度。当酶标仪显色足够进行吸光度读取是立即用终止液终止反应 |
| 底物溶液或终止液不是新鲜配制的 | 使用新鲜配制的底物溶液。终止液应该是清亮的（如果它变黄，这是被污染的标志，需要重新配制） |
| 没有终止反应 | 如果底物反应没有被终止，颜色会继续变化 |
| 酶标板在酶标仪度板前放置时间过长 | 颜色会继续变化（尽管加了终止液，依然会以很慢的速度变化） |
| 实验器皿污染 | 确保试剂是新鲜配制的并且使用的是清洁的玻璃器皿 |
| 底物孵育过程没有曝光 | 底物孵育应该在避光条件下进行 |
| 孵育温度过高 | 抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性。确保孵育在正确的温度下进行，孵育箱要设定好温度并正常工作，孵育温度可能需要一些优化 |
| 抗体非特异性结合 | 确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用5-10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。确保孔板进过预处理以防止非特异性结合。使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收 |
三、吸光度数值低
| 可能的原因 | 解决的方法 |
| 使用的样品中没有显示靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低 | 检查靶蛋白表达系统，确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低，需要增加样品使用量，或者您可能需要选择一个更加灵敏的检测方法。确保您使用的是没有超过测定方法检测范围的阳性对照 |
| 抗体不足 | 确定使用的是建议的抗体量，为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度 |
| 底物溶液不是新鲜配制或成分有误 | 使用新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且正确保存，使用的浓度也是正确的，确保试剂按正确的浓度使用 |
| 试剂不是新鲜配制或pH值有误 | 确保试剂配制正确并在有效期内 |
| 孵育时间不够长 | 如果建议了孵育时间，确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想，孵育时间可能需要增加 |
| 孵育温度太低 | 抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性，确保孵育时在正确的温度下进行，孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。确保所有的试剂在使用前是室温 |
| 未加终止液 | 加入终止液可以增加显色反应的强度，也能固定反应最终的颜色 |
四、吸光值高
| 可能的原因 | 解决的方法 |
| 样品和/或阳性对照吸光度数高。吸光度没有按样品在板上的稀释梯度递减 | 样品或阳性对照的浓度过高，超出了实验方法检测的范围。重新设置实验方法或者在加样前稀释降低样品和对照的浓度，在处理结果计算浓度时考虑到所作的稀释 |
五、酶标板上吸光度不规律
| 可能的原因 | 解决的方法 |
| 吸液不一致 | 确保移液器使用正确并进过校准、确保枪头差的足够紧密。板子稀释时要特别仔细，注意确保每个枪头都吸上和排除正确量的液体，这对平行样品结果的一致性有很大影响 |
| 抗体稀释液/试剂 | 为保证板子所有孔的浓度一致，确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被均匀混合 |
| 孔板变干涸 | 确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘（确保清洁，无菌水）在孵育箱底部 |
| 洗板不充分 | 这将导致一些孔没有其他孔清洁的好，残留不同量的未结合的抗体，使后面的结果产生不一致 |
| 酶标板底部不净影响吸光度读取 | 读板前小心清洁酶标板底部 |