两篇文章带你深入了解铁死亡！

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁离子依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型程序性细胞死亡形式。既然是一种程序性细胞死亡，这意味着它可以被调控。
从发生机制上讲铁死亡主要是在二价铁离子或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质体过氧化，从而诱导细胞死亡，还表现在抗氧化体系谷胱甘肽GSH和谷胱甘肽过氧化物酶4-GPX4的表达量降低。
铁死亡主要有以下几个特点：
(1)细胞形态方面：铁死亡会导致细胞线粒体变小，膜密度增高，嵴减少、消失，外膜破碎。细胞核中形态变化不明显。
(2)细胞成分方面：铁死亡表现为脂质过氧化增高，ROS升高。也有一些特征基因发生变化。
 

铁死亡通路图

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从过去几年国家自然科学基金中标的项目我们发现，从2013年申请第一项关于“铁死亡”的项目，2017年增加到16项，到2019年增至76项，累计资助经费6008.2万，都说明了铁死亡研究不断受到科学家的重视，成为细胞死亡研究新的“宠儿”。
 

图1：关键词“铁死亡”检索国自然科学基金（未包括关键词“Ferroptosis”）

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“铁死亡”入选中国科学院2019生物科学领域TOP 10（图2）
 

图2：《2019研究前沿》生物科学领域TOP 10

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铁死亡作为科研界的热门研究方向之一，大家最关心的也就是铁死亡的研究思路和新的文章了。接下来，我们一起分析下两篇关于铁死亡的高分文章呀！
第一篇是关于p53能够通过SLC7A11调节胱氨酸代谢，调控ROS应答并通过铁死亡抑制肿瘤生长，第二篇则是今年发表在nature research上的关于能量胁迫可以激活AMPK激活，从而抑制ACC并降低花生四烯酸这个多聚不饱和脂肪酸的合成，最终抑制铁死亡。

01  Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression
早在2015年细胞生物学领域著名华人科学家顾伟教授在nature在线发表了一篇关于经典肿瘤抑制因子p53介导铁死亡过程，抑制肿瘤生长的文章。接下来跟大家一起看看这篇文章研究思路吧。
p53是一个经典的肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。p53介导的细胞周期停滞、衰老和凋亡对抑制肿瘤的发展具有重要作用，同时研究也表明p53对细胞代谢活性的调节在其发挥抗肿瘤作用中也十分重要。
 

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图一、SLC7A11基因是p53的靶点

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a、在经过doxycycline 诱导的细胞中，WB和RT-PCR结果显示p53的激活会伴随着SLC7A11水平的降低；
b、SLC7A11的基因序列也显示其上存在p53的结合位点；
c、EMSA实验也显示，重组全长人类野生型p53与含有该位点的放射性标记寡核苷酸探针孵育后，可以鉴定出p53–DNA复合物；
d、ChIP 实验也验证了p53和SLC7A11的DNA序列存在相互作用；
e、用nutlin-3处理细胞，使p53激活/干扰掉p53时，SLC7A11的蛋白质水平伴随着显着降低/升高。这组实验充分说明了SLC7A11基因是p53介导的转录抑制的靶点。
既然SLC7A11是P53的靶点，那p533KR作为p53蛋白的一种乙酰化缺陷突变形式，但是它对SLC7A11的表达有作用吗？
接下来的一组实验则说明了p533KR虽然不能够诱导细胞周期暂停，衰老和凋亡过程，但完全保留了对SLC7A11表达的调控能力，并能够促使细胞在ROS诱导的应激状态下发生"铁死亡"过程。
 

图二、p533KR可以调节SLC7A11基因的表达和细胞对半胱氨酸的摄取

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a、在细胞中用四环素诱导p533KR的表达，发现p533KR能够激活TIGAR和MDM2的表达，但不能激活p21或PUMA的表达，但是在p533KR诱导后的不同时间点，SLC7A11的水平都大大降低了；
b、ChIP 实验也验证了p533KR可以和SLC7A11的DNA序列可以相互作用；
c、在源自p53+/+、p533KR/3KR和p53-/-小鼠的MEF中，相对于野生型MEF，SLC7A11在p53–/–的细胞中表达明显增加，然而在p533KR/3KR细胞中的SLC7A11转录水平仍然很低，这表明p533KR可以抑制SLC7A11的表达；
d、在四环素诱导的p533KR细胞中发现细胞对胱氨酸摄取能力下降；
e、在源自p53+/+、p533KR/3KR和p53-/-小鼠的MEF中，p53-/-实验组对胱氨酸的摄取增加到比p53+/+组高出约60％的水平，这证明p53的缺失促进了细胞对胱氨酸的摄取，但是在p533KR/3KR实验组中细胞对胱氨酸的摄取没有变化，这表明p533KR/3KR保留了抑制细胞摄取胱氨酸的能力。
这组实验说明了p533KR可以调节SLC7A11基因的表达。
SLC7A11是质膜转运蛋白的关键成分，它可以介导细胞Na+依赖性的对胞外胱氨酸的摄取，以换取胞内谷氨酸。为了探索p53对SLC7A11抑制的功能，研究进一步分析了p53的激活对细胞摄取L--胱氨酸的影响。
研究表明，SLC7A11的表达对于铁死亡也很关键，在特死亡发生的过程中涉及到代谢功能的异常。p53既然能够调控SLC7A11的表达，也能影响细胞对胱氨酸的摄取，那p53是否能够铁死亡呢？接下来进行了如下实验。
 

图三、p53对铁死亡的调控作用

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a、用铁死亡诱导剂erastin 处理小鼠的MEF细胞8h，发现p53+/+、p533KR/3KR组的中细胞死亡率超过48%，但在p53-/-实验组中细胞死亡率保持在20%的低水平。这说明p53的缺失可以避免erastin诱导的铁死亡；
b、通过代谢动力学分析，在6小时后在p53+/+、p533KR/3KR组的MEF细胞中可以很容易就检测到细胞死亡；
c、在经过erastin处理的细胞中，我们观察到线粒体收缩，膜密度增加，但没有明显的DNA断裂；
d、用铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1处理细胞，结果发现ferr-1可以抑制p53+/+和p533KR/3KR组的ME细胞死亡，但是其他细胞死亡抑制剂，如自噬（3-甲基精胺），细胞凋亡（Z-VAD-FMK）和坏死病（necrostatin-1）的抑制剂，均不能抑制erastin诱导的细胞死亡。这组实验说明了p533KR可以调节细胞对胱氨酸的摄取和促进铁死亡。
有研究表明，SLC7A11在多种形式的人类癌症中均过表达，p53可以调节SLC7A11基因的表达，那p53可以通过SLC7A11来抑制肿瘤生长吗？
 

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图四、SLC7A11的表达对抑制p533KR诱导的肿瘤生长的作用

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a、HE染色表明，SLC7A11在成对的结肠癌的邻近正常组织上没有检测到，但成对的结肠癌的质膜上检测到明显的SLC7A11；
b-c、在用erastin诱导SLC7A11的质粒转染的p533KR H1299 细胞中发现，SLC7A11过表达可以减轻p533KR依赖的铁死亡；
d-e、异种移植肿瘤生长试验也表明，p53缺失的肿瘤组织生长显着降低，但是在SLC7A11过表达的情况下，的抑制作用被很大程度上被减弱。这些数据表明SLC7A11的表达对抑制p533KR诱导的肿瘤生长至关重要。
多项研究表明，p53在细胞凋亡，细胞生长停滞和衰老中的典型活性是导致p53+/+Mdm2-/-小鼠胚胎致死性的主要原因。为了进一步探究进行了如下实验。
 

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图五、p53介导的代谢调节胚胎发育的影响

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a、检查了从p533KR/3KRMdm2+/-小鼠获得的胚胎，发现p53染色显着升高，但发育结构基本正常，这表明p533KR突变能够促进胚胎发育；
b、同时检测了p533KR/3KRMdm2+/-及其他实验组小鼠胚胎中Slc7a11  mRNA的量，发现p533KR/3KRMdm2-/-组的Slc7a11  mRNA明显下调；
c、经过ferr-1处理的p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎在E14.5天（II）表现出明显的器官发生，例如眼部形成和四肢分化。而此时未经处理的p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎却未成形，再重新经过ferr-1处理后胚胎也在长大，眼睛的结构得到了明显改善；
d、Ptgs2在p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎中显着上调，但在p53-/-Mdm2-/-组胚胎不受影响，这表明p533KR/3KRMdm2-/-胚胎中Ptgs2的上调是p53依赖性的。
这组数据表明，p53介导的对代谢调节和铁死亡的影响对p533KR/3KRMdm2-/-胚胎发育至关重要。
通过对突变小鼠进行分析，研究人员发现这些p53的非经典活性能够促进胚胎发育以及与MDM2缺失相关的致死。同时，研究人员还发现SLC7A11在人类肿瘤中高表达。
为了在更佳的代谢条件下研究铁死亡，文章进一步分析了p533KR介导的铁死亡是否与ROS应激反应有关。最终发现，其过表达能够抑制ROS诱导的"铁死亡"并减弱p53 3KR介导的对肿瘤生长的抑制作用。
 

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图六、p53介导的铁死亡对ROS应答的作用

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a、仅分别通过p533KR诱导或ROS处理均未观察到明显的细胞死亡，但是同时经过p533KR诱导和ROS处理可诱导大量细胞死亡，而这种死亡可被ferr-1特异性抑制；
b、过表达SLC7A11也可以抑制经过p533KR诱导和ROS处理诱导的细胞死亡；
c、Nutlin-3对U2OS细胞进行处理，诱导了高水平的p53表达，而没有引起细胞死亡，而仅用ROS的处理组则没有诱导p53激活，也未能引起细胞死亡，但是在Nutlin-3和ROS共处理组出现了大量得到细胞死亡；
d、WB结果显示，相对于对照MEF组，Slc7a11-BAC组中的SLC7A11蛋白水平明显升高；
e、在野生型MEF中，用ROS或erastin处理均增强了铁死亡，但在Slc7a11-BAC组中铁死亡大大减弱。
这些数据表明，ROS特异性诱导了p53介导的铁死亡，而SLC7A11的水平对这一过程至关重要。
这项研究表明p53能够通过调节胱氨酸代谢，ROS应答和"铁死亡"抑制肿瘤生长的新模式，进一步拓展了人们对经典抗肿瘤因子p53的新认识，具有重要意义。
文章学习之后，小优给大家总结了本篇文章中涉及到的部分相关产品：

 

02  Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis

硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的主要调节剂，铁死亡是铁依赖性脂质过氧化诱导的程序性细胞死亡的一种形式。GPX4 将脂质氢过氧化物转化为无毒脂质醇，从而防止了铁锈病。
研究表明，硒可增强 GPX4 表达并抑制铁传染性死亡以保护神经元。另外，某些抗治疗性癌细胞依靠 GPX4 存活。许多癌细胞主要通过胱氨酸、谷氨酸获得半胱氨酸反转运蛋白被称为系统XC−介导的胞外胱氨酸的转运，相应地，胱氨酸耗竭、抑制系统XC−介导的胱氨酸转运或RSL3失活GPX4可诱导铁死亡。
本篇文章主要能量代谢与铁死亡之间展开研究，详细分析了两者之间的联系。
 

图一：能量胁迫抑制铁死亡

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a-b、显微镜下观察发现，无糖培养可以抑制铁死亡诱导剂Erastin诱导的MEFs细胞死亡；
c、无糖培养发现可以抑制胱氨酸缺失诱导的MEFs细胞死亡；
d、无糖培养可以抑制GPX4抑制剂RSL3诱导的MEFs细胞死亡；
e、无糖培养可以抑制诱导GPX4敲除诱导的MEFs细胞死亡；
f-h、AMPK的抑制剂A769662、AICAR和2DG）以及缺糖处理都可以显著抑制erastin、胱氨酸缺失以及RSL3诱导的细胞死亡；
i-k、AMPK抑制剂和缺糖处理都可以显著抑制erastin、胱氨酸缺失以及RSL3诱导的脂质过氧化作用。
以上数据表面，不同的方法分别诱导细胞铁死亡，均发现了无糖培养可以抑制被诱导的细胞铁死亡现象，这说明提示葡萄糖能量胁迫可以抑制MEFs细胞铁死亡，同时也发现了AMPK抑制剂能够发挥与葡萄糖缺失相同的对铁死亡抑制的效果。
   

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图二：能量胁迫可以通过AMPK抑制铁死亡

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a、WB结果显示，AMPK-DKO MEFs细胞中，AMPKα水平显著低于野生型；
b-c、AMPK-DKO几乎完全逆转了A769662、2DG、缺糖诱导的MEFs细胞铁死亡；
d、WB结果表明，14种不同的肿瘤细胞中，发现SLC7A11表达量低的细胞系中，p-AMPK表达量也相对较低；
e-f、Erastin诱导后，SLC7A11和p-AMPK表达量低的细胞系死亡率显著升高；
g-h、胱氨酸缺失处理后，SLC7A11和p-AMPK表达量低的细胞系死亡率显著升高。
这组数据表明p-AMPK的激活与SLC7A11的表达缺失会显著增强铁死亡诱导剂对铁死亡的诱导效果。
 

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图三：AMPK失活使细胞对铁死亡敏感

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a、在p-AMPK高表达的ACHN细胞中发现，用erastin和AMPK抑制剂compound C同时处理时，细胞死亡率显著升高，但这一现象可以被Ferr-1和ROS抑制剂NAV逆转，但不能被caspase抑制剂Z-V或细胞坏死抑制剂Nec逆转；
b、用Cystine和compound C同时处理ACHN细胞时，细胞死亡率显著升高，且可以被Ferr-1、NAV抑制，但不能被Z-V、Nec抑制；
c、电镜结果显示compound C和Erastin处理的ACHN细胞表现出线粒体萎缩，膜密度增加，细胞核内没有明显的DNA断裂，表现出明显的铁死亡特征；
d-e、在p-AMPK低表达的Caki-1细胞中过表达AMPK，使AMPK与p-ACC表达量升高，结果抑制了erastin诱导的铁死亡；
f-k、ACHN细胞Cas9进行AMPKα1/α2 DKO处理后，明显增加了对erastin/Cystine缺失诱导铁死亡/脂质过氧化作用的敏感性；
l-m、在AMPKα1重新表达的ACHN细胞中，AMPK、p-ACC的表达量明显升高，且相比AMPK突变体T172A、AMPKα2，AMPKα1的重新表达更能够抑制Cystine缺失诱导的ACHN细胞铁死亡；
f-m、在缺失AMPKα1的细胞中再次恢复它的表达，结果表明AMPK对铁死亡有调控作用。
以上数据表明，p-AMPK的表达量高低，显著影响了细胞对铁死亡（不是凋亡、也不是坏死）诱导的敏感度。AMPK失活后，使细胞对铁死亡更加敏感。
   

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图四：AMPK介导的ACC磷酸化可抑制铁死亡

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(a-F).和能量胁迫类似，用TOFA（ACC抑制剂）处理后可以显著的抑制erastin/Cystine缺失/RSL3诱导的MEFs细胞系铁死亡，和脂质过氧化作用。
(g-h).TOFA处理后，AMPKα1/α2 DKO导致的ACH细胞脂质过氧化作用/铁死亡明显缓解。
(i).ACC double knock-in (DKI)小鼠来源MEFs，其中ACC1 (S79)和ACC2 (S212)上的AMPK磷酸化位点均突变为丙氨酸。
(j-l).类似AMPK DKO，AMPK磷酸化位点突变后可缓解A769662/AICAR/能量胁迫处理后由Erastin导致的铁死亡抑制。
以上fig4说明，AMPK介导ACC磷酸化，对铁死亡有抑制作用。
 

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图五：AMPK调节PUFA在细胞内的脂质积聚

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a、在经过可逆的AMPK激活剂A769662处理MEFs细胞中发现，64种脂类水平显著降低；
b、AMPK DKO ACHN细胞与WT ACHN细胞相比，73种脂质相对丰度显著增加；
c、结合a和b的分析发现了17种脂类在A769662（AMPK激活剂）处理MEFs中下调，而在ACHN AMPK缺失细胞中上调；
d-e、二高γ亚麻酸、PUFA在A769662处理的MEFs细胞中下调，但在ACHN AMPK缺失细胞中上调；
f-g、二高γ亚麻酸前体、花生四烯酸可以使经过A769662处理的MEFs/AMPK  ACHN细胞对erastin诱导的铁死亡更敏感。
以上一组数据说明， AMPK的表达高低可以显著调节花生四烯酸在细胞内的积聚，从而影响细胞对铁死亡的敏感度。
 

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图六：AMPK的活化可保护IRI的肾脏损伤

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a、实验结果显示，胰岛素IRI高的小鼠，肾上皮细胞出现明显的铁死亡相关形态学改变，如线粒体变圆，嵴加深等形态特征；
b、WB结果表明，AICAR或2DG治疗显著增加了肾脏中AMPK的磷酸化水平；
c-d、HE染色结果显示，AICAR或2DG治疗和fer-1一样，对IRI肾脏组织损伤有一定的保护作用；
e-g、在AMPK DKO的小鼠中，AICAR对IRI肾损害和血尿素氮水平的保护作用大部分被消除；
h-i、免疫组化结果显示，在AMPK DKO的小鼠中，IRI WT中的4-HNE降低，IRI+AICAR中4-HNE的水平又有上升。
这组实验结果表明AMPK活化可对肾细胞的铁死亡产生抑制，进而保护IRI的肾脏损伤。
本篇文章用到的部分相关抗体整理如下：

文章分析完了，接下来让我们一起了解下目前检测铁死亡的方法吧。
1、检测相关指标的相关活性：
①可以通过检测细胞活性来判断细胞是否发生了铁死亡：如常用的检测方法CCK-8和MTT；
②可以检测细胞内铁水平来分析细胞铁死亡的情况：使用PGSK探针检测，通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱；或者使用Iron Assay Kit检测细胞、组织中的铁水平。
③可以判断细胞内活性氧的水平来检测细胞的铁死亡：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式的方法，检测DCFH-DA（表达上调）或C11-BODIPY荧光探针，在铁死亡细胞中，DCFH-DA会表达上调，C11-BODIPY荧光探针会由红色转化为绿色。
④通过常用的qPCR/WB方法对铁死亡进行检测：检测细胞内与铁死亡相关因子的变化，如COX-2，ACSL4，PTGS2，NOX1，GPX4和FTH1等，其中COX-2，ACSL4，PTGS2和NOX1在铁死亡的细胞中表达上调，GPX4和FTH1在铁死亡的细胞中表达下调。

2、观察细胞的形态特征：
①透射电镜直接对细胞形态进行观察：细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大。
②对线粒体膜电位进行检测：通过流式的方法收集TMRE阳性细胞的比例来判断细胞是否发生铁死亡。
③观察线粒体的形态变化：向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态是否发生相关的变化。
检测铁死亡的相关产品：